0 摘要

反向遗传学被认为是一种不可或缺的工具，它彻底改变了我们对病毒发病机制和疫苗开发的认识。大型的RNA病毒基因组，如冠状病毒基因组，由于基因组较大且不稳定，很难在大肠杆菌宿主中克隆和操作。

该研究团队此次报道了一个基于酵母（Saccharomyces cerevisiae）的合成基因组学平台，能够根据已知病毒基因组，在合成基因片段（来源：病毒中提取、对病毒DNA的克隆、临床的样品或是人工合成的DNA）后一周内，对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）进行基因组重建、改造以及病毒拯救（virus secure），即实现无需从病人体内分离病毒，直接使用酵母快速生产出大量有活性的新型冠状病毒（由于技术原因并未完全实现）。除此之外，该团队还对冠状病毒科、黄病毒科和副粘病毒科的其它RNA病毒的基因组进行了重建和拯救，拯救的成功率可达90%以上。这一技术可对突然爆发的病毒疫情快速做出反应，可以在爆发期间实时生成不断发展的RNA病毒变体并对其功能进行表征，大大减少了因病毒变异给研究带来的困难。

1 通讯作者介绍

两位通讯作者均来自瑞士的University of Bern

2.1 研究背景—理论基础

Transformation-Associated Recombination cloning  TAR克隆

基因组DNA片段和过量的TAR载体在去除细胞壁的酵母细胞中进行混合。每个载体中都含有对目的基因特异的两段序列（标为蓝色和红色）以及酵母的筛选标记HIS3和CEN6（淡蓝色原点）。由于载体过量，酵母细胞便会将DNA片段全部接受。根据具体情况又可分为三类：1）未分到基因组DNA的；2）分到基因组DNA但未被整合到TAR载体上的；3）分到基因组DNA且通过自身同源重组被整合到TAR载体上的。显然我们是只需要第三种情况的阳性克隆，怎么把其它两种过滤掉呢？答案是进行电泳。

下图是对上述过程的简化示意：

2.2 研究背景—首次实现

2010年5月20日，J. Craig Venter Institute在美国Science 杂志上报道了首例人造细胞的诞生。向山羊支原体 Mycoplasma capricolum 细胞中转入人工合成的蕈状支原体Mycoplasma mycoides 的基因组而来，产生的人造细胞表现出的是蕈状支原体的生命特性。

3.1 SARS-CoV-2病毒的重建

3.1.1 SARS-CoV-2重建与SARS-CoV-2大流行关键事件的时间线

注：时间轴上方为国际标志性事件，下方为实验的关键性步骤时间节点  

3.1.2 实验流程概述

注：VeroE6 Cell 非洲绿猴肾细胞

3.1.3 病毒拯救与活性检测

利用该平台，研究人员在拿到合成DNA片段后一周内，对新冠病毒进行了基因组改造和病毒拯救。研究团队于1月14日向试剂公司下单，以化学合成方式得到上述14个DNA片段，并在2月4日拿到其中的12个含片段载体（有pUC57、pUC19、pUC57mini和PCC1-His3）。其中片段5 和7 未获得，原因不详。研究团队最终通过对一位来自慕尼黑患者的新冠病毒样本（BetaCoV/Germany/BavPat/2020）进行RT-PCR 扩增，获得了第5和第7个片段。

利用TAR 克隆，研究人员获得了6 组正确组装的新冠病毒构建体的分子克隆。随后用酵母的同源重组系统依据末端重复的序列将这些DNA 序列拼到一起。获得完整的病毒序列后，用T7 RNA 聚合酶将其通过脱落转录，得到病毒RNA，将该RNA 用电穿孔技术导入到非洲绿猴肾细胞（VeroE6 cell）中，使其感染。将用于培养绿猴肾细胞（~2d），含释放出的病毒颗粒的上清液注入到别的培养基中，发现可以感染别的细胞，说明新构建的酵母合成平台可以拯救病毒。

3.2 MHV与MARS-CoV的重建

同理，作者团队在鼠肝炎病毒A59（MHV-A59）和MERS-CoV进行病毒拯救的测试，发现效果依旧很好，测试的克隆中正确组装了病毒基因组的YAC均可达到90％，这表明病毒在酵母中的组装效率相当之高。

4 小结

TAR 克隆系统的一个最重要的优点就是可以先对全基因组进行设计，通过对小的具有重复序列的片段的合成，进而再依靠酵母的同源重组系统进行片段的正确组装，极大的降低了合成的难度，也大幅提高了合成的效率。无需得到变异毒株的临床样本，通过对病毒变异的分析，可以合成构建出该变异毒株的基因组片段，再通过酵母平台进行重建与拯救。论文中还提到对局部片段的重新设计，以测试改变前后对病毒的影响。

总的来说，这一方法即利用酵母人工染色体在酵母体内将合成的SARS-CoV-2的DNA片段进行体外重组，获得全长cDNA克隆。再将cDNA体外转录为RNA，利用电穿孔将病毒RNA转染进哺乳动物细胞，实现病毒拯救。

化学合成的基因组DNA所产生的SARS-CoV-2可以绕开病毒分离物的来源限制，而且还可以对单个基因进行遗传修饰和功能表征。

5 后记

对于这一篇论文，我起初有许多地方不明白。

首先是病毒的基因组合成，理论上讲，比病毒更高级的生物基因组，并不是没有人合成出来过，因此这篇论文的技术可以说是降维打击了，那为什么还可以发表在顶级杂志Nature上呢？

从时间线上进行分析，我们可以得知，1月11日病毒序列正式被公布（据我所知应该是中国CDC发布的），但是国外第一个提取出病毒毒株的时间却是到了2月26日，与序列的公布整整相差1个多月。我们也可以知道这次的Pandemic，一个多月可以新增多少感染者和死亡者，时间就是生命啊！而作者在序列公布后的第3天便下出了订单，在ICTV正式公布新冠病毒名称的第2天便得到了拯救完成的病毒。可以想象，如果以后没有可能及时得到病毒的毒株，我们可以直接根据序列得到病毒的毒株，这是本篇文章最大的亮点之一，即在此类形势下给人一种研究病毒的范式。

第二个亮点，可以关注到作者不仅做了SARS-CoV-2，还做了MHV和MARS-CoV。看不明白的话给个提示：这三种病毒都是冠状病毒科（Coronaviridae ）的！此外，作者在表格中还列出未实现拯救的人呼吸道合胞病毒（hRSV-B）、寨卡病毒（ZIKA virus）和流感病毒（HCoV）。这意味着作者想通过对一系列冠状病毒的拯救验证来说明这一平台广泛的适用性，将难缠的冠状病毒，乃至其他病毒的毒株获取难度降低。这或许对科学界是件好事，但是可能也是件坏事吧…

拓展阅读关键词：

Craig Ventor；冠状病毒亚基因组；

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参考文献：

[1] Thao, et al. Nature , 2020. 

[2] Natalay Kouprina & Vladimir Larionov. Nat Protocol , 2008.

[3] Daniel G. Gibson, et al. Science , 2010. 

[4] 孙明伟, 李寅, 高福. 生物工程学报 , 2010.