**背景 **干扰素-γ(IFN-γ)通常被称为II型干扰素，是一种协调肿瘤免疫过程的重要细胞因子，在肿瘤免疫治疗研究中受到广泛关注。既往研究探讨了IFN-γ在特定肿瘤或疾病中的作用和机制，但IFN-γ在泛癌中的相关作用尚不明确。
**方法 **下载TCGA和GTEx RNA表达数据及临床资料。此外，作者利用生物信息学方法分析了IFN-γ在肿瘤中的作用，包括分析不同肿瘤中IFN-γ与表达、预后、功能状态、TMB、MSI、免疫细胞浸润、TIDE的相关性。作者还开发了一个用于网络拓扑分析的PPI网络，将中心基因识别为那些程度大于IFN-γ水平的基因。
结果 IFN-γ在大多数肿瘤类型中均有差异表达，并可预测不同的生存状态。此外，IFN-γ表达与T细胞浸润、免疫检查点、免疫激活基因、免疫抑制基因、趋化因子和趋化因子受体以及肿瘤纯度、功能状态和预后价值密切相关。此外，预后、CNV和治疗反应均与IFN-γ相关基因表达显著相关。其中，IFN-γ相关基因STAT1在UCEC中SNVs和SNPs的比例最高。在多种肿瘤类型中均发现IFN-γ相关基因表达水平升高，这与20种不同类型药物的药物敏感性呈正相关。
**结论 **IFN-γ是肿瘤免疫治疗反应的良好指标，有可能限制肿瘤进展，为未来免疫治疗的发展提供了新的途径。
本研究的工作流程
研究结果
IFN-γ相关基因在泛癌中的差异表达及其对预后的影响
最初，作者对各种癌症中与IFN-γ相关的基因表达谱进行了分析，并观察了它们在不同肿瘤类型中的表达水平变化。利用热图，检测了33种不同肿瘤类型中10个IFN-γ相关基因的表达，并发现在同一肿瘤中以及不同肿瘤类型中基因表达的差异。值得注意的是，在研究基因中TGCT、LUSC、LUAD、KIRC、HNSC、DLBC和CHOL表现出高表达，而UVM、PCPG、LGG、KICH和ACC表现出低表达(图1A)。在预后影响方面，作者发现所选的10个基因中的大多数高表达与LGG和UVM患者的无进展生存期( PFS )、总生存期( OS )和无病生存期( DSS )缩短有关，表明风险增加。相反，基因高表达的SKCM患者具有更高的DSS、OS和PFS，提示具有保护作用(均P < 0.05)。此外，STAT1 的高表达与 PAAD 或 ACC 患者较高的 DSS 和 OS 有关。(图1B)。这些结果提示，IFN-γ相关基因的表达与肿瘤患者的预后相关，且相关程度取决于肿瘤的具体类型。
图 1 不同IFN-γ相关基因(IFN-γ-RGs)在各种癌症中的预后意义
IFN-γ相关基因及基因突变分析
为了研究基因突变对基因表达的影响，作者分析了不同肿瘤中IFN-γ相关基因的突变状态。作者的研究检查了33种不同癌症中与IFN-γ相关的基因的遗传变异，发现在大多数恶性肿瘤中，这些基因与拷贝数变异(CNV)有关。在作者调查的9个基因中，杂合子扩增和杂合子缺失是在33个不同癌症中观察到的最常见的突变。其中，杂合扩增是IDO1、STAT1和IFNG中最常见的CNV类型，而杂合缺失是CCR5、CXCL11、CXCL10、CXCL9、PRF1和GZMA在25个肿瘤中最常见的CNV类型。此外，在肾上腺皮质癌(ACC)病例中，杂合扩增是CNV的主要类型(图2A)。
此外，作者还进行了额外的研究，以探索与IFN-γ相关基因的相对线性拷贝数值与mRNA表达水平之间的关系。作者的数据显示，CCR5、GZMA、IDO1、PRF1和CNV的表达在肺鳞癌(LUSC)和头颈部鳞癌(HNSC)中均呈强正相关。相反，作者在肾乳头状细胞癌(KIRP)中观察到CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达与CNV呈强烈的负相关，这是一个重要的发现(图2B)。此外，作者发现STAT1的表达与CNV之间存在很强的相关性。。
图 2 33种不同癌症中IFN-γ相关基因拷贝数变异(CNV)的分布，及CNV与mRNA表达的相关性。
作者检测了每一种癌症类型中IFN-γ相关基因的突变和变异类型，发现子宫内膜癌(UCEC)在STAT1中单核苷酸变异(SNVs)的百分比最高(33%)，其次是皮肤黑色素瘤(SKCM)、结肠腺癌(COAD)、胃腺癌(STAD)。直肠腺癌(READ)，膀胱尿路上皮癌(BLCA)，LUSC和肺腺癌(LUAD)。CASP1在UCEC、SKCM、LUSC、BLCA和LUAD中具有高比例的SNV。在SKCM和UCEC中，STAT1、PRF1、IDO1、GZMA、HLA-IgM、IFNG和CCR 5的SNV发生率较高。CXCL10和CXCL11中的SNV比例较低(图2C)。上述10个基因是泛癌单核苷酸多态性(SNPs)错义突变最常见的靶点。UCEC和SKCM患者的基因改变频率最高，其次是STAD、COAD、BLCA和胰腺腺癌(PAAD)。STAT1的SNPs比例最高(27%)，其次是PRF1(23%)、IDO1(17%)和GZMA(15%)(图2D)。这些发现表明，IFN-γ相关基因在各种肿瘤中具有高频率的突变，并有可能成为进一步靶向治疗分子。
图 2 SNV百分比热图，SNV Oncoplot.
泛癌组织中IFN-γ相关基因甲基化差异分析
异常的DNA甲基化可能导致异常的基因表达和增加癌症的风险。作者研究了13种不同类型的癌症中IFN-γ相关基因的差异甲基化，以了解这些基因如何影响肿瘤的发生，并揭示这些基因异常表达的机制。IDO1在KIRP、LUAD、THCA和ESCA中甲基化水平较高，而在LUSC和BRCA中甲基化水平显著较低。在10个被研究的基因中，几乎所有的基因在BRCA、KIRC、LIHC和HNSC中都表现出低的甲基化水平。在13种肿瘤中，STAT1、IFNG和CCR5在BRCA、KIRC、LIHC、HNSC、UCEC和BLCA中甲基化水平较低(图3A)。为了理解甲基化和IFN-γ mRNA表达之间的关系，作者在31种癌症亚型中发现了强负相关。甲基化与这些恶性肿瘤中PRF1、CCR5、STAT1、GZMA、HLA-DRA和CXCL10的表达呈负相关。相反，甲基化与IDO1在BRCA、THCA、SKCM、CESC、LUAD、PAAD、HNSC、STAD、BLCA、LIHC、COAD、READ和ESCA中的表达呈正相关(图3B)。这些结果表明，IFN-γ相关基因的异常表达部分是由于异常甲基化调控。
图 3泛癌组织中IFN-γ相关基因差异甲基化分析
IFN-γ评分的差异表达及其与肿瘤分期的关系
首先，作者发现与IFN-γ相关的基因之间存在正相关(p<0.05)，表明IFN-γ-RGs之间存在密切相关(图4A)。作者还使用GTEx和TCGA数据评估了33例恶性肿瘤的肿瘤和正常标本之间的IFN-g评分。与正常组相比，UCS、BRCA、UCEC、COAD、TGCT、OV、LIHC、LAML、PAAD、KIRC、PRAD、GBM、LGG、READ、ESCA、SKCM、DLBC、STAD、CESC、THCA、BLCA、ACC等癌组织中IFN-γ评分显著升高。33个肿瘤中有22个IFN-γ评分高于正常组织，提示癌组织炎症反应明显增强(图4B)。进一步研究不同分期的泛癌患者IFN-g评分。IFN-γ 评分在TGTC、HNSC和COAD早期显著升高(均P < 0.05)。IFN-γ 评分在KIRP晚期较高(均P < 0.05)。可以推断，IFN-γ 可能是TGTC、HNSC、COAD早期防治的突破。
图 4 IFN-γ评分差异表达
IFN-γ评分对肿瘤预后的影响
作者探讨了IFN-γ在TCGA泛癌中的预测意义。Cox回归分析显示，IFN-γ在SKCM、SARC、OV、MESO、LUAD、LIHC、HNSC、DLBC、CESC、BRCA、BLCA、THCA和ACC患者中具有保护作用(均P< 0.05，图5A)。DSS分析结果证实了IFN-γ在BRCA、THCA、SARC、MESO、OV、CESC、LUAD、SKCM、BLCA和ACC中的保护作用(均P< 0.05，图5B)。来自PFI分析的发现说明了IFN-g在BLCA、SKCM、LUAD、CESC、OV、LIHC、COAD、CHOL、BRCA、SARC、HNSC和ACC中的保护功能（所有P< 0.05，图5C）。KM分析确定更高的IFN-γ评分与ESCA、KIRC、LUAD、CESC、SARC、SKCM、STAD和DLBC中OS的改善相关。在MESO、LUSC、UCS、BRCA、OV、LUAD、CESC、HNSC、SARC、BLCA、SKCM、THCA和ACC中，更高的IFN-γ表达与OS和DSS的改善相关。在OV、BLCA、STAD、HNSC、SKCM、CESC、LUSC、CHOL、LUAD、MESO、BRCA、COAD、LIHC、AD和ACC中，较长的PFI与较高的IFN-γ评分相关。从这些结果来看，IFN-γ评分可以提高经典预后标志物的预测意义。此外，IFN-γ与许多类型的恶性肿瘤的预后密切相关，提示它可能对这些肿瘤患者的预后有有益的影响。此外，作者对免疫激活基因、免疫抑制基因、免疫检查点、趋化因子、趋化因子受体基因集进行了GSEA分析，并比较了癌与癌旁基因的变异性。结果显示，上述基因集得分在肿瘤中或高或低，缺乏类似于IFN-γ相关基因一致性的结果。此外，作者对上述基因集进行了每次10个基因的20个随机样本，以获得20个随机免疫基因集并进行GSEA分析。结果与之前的结果相似，在肿瘤中未观察到基因组有一致的上调或下调趋势。上述结果表明，肿瘤中IFN-γ相关基因的表达状态受其背后的生物学机制调控，而不是由任意一组免疫基因获得的巧合结果。
图 5 IFN-γ
枢纽基因的定义和免疫组化验证
为了得到枢纽基因，将IFN-基因导入到Cytoscape程序中，然后创建一个PPI网络图。蛋白质由节点表示，而这些蛋白质之间的联系强度由链接表示。可以看出，在PPI网络中，共有19个节点，92个连接。STAT1基因具有最大程度的相关性，被认为是hub基因(图6)。STAT1在恶性乳腺组织中显著过表达（图7，P=4.7e-6），这与作者的研究结果一致。
图 6 蛋白质相互作用(PPI)网络的构建
图 7 应用免疫组化方法验证STAT1在乳腺恶性肿瘤及癌旁组织中的表达
IFN-γ单细胞功能分析
通过检查CancerSEA数据集，作者将IFN-γ评分与14种不同的癌症功能状态进行了比较。静止、分化、血管生成、转移、EMT等功能与UM的13项功能呈负相关。在11种类型的肿瘤中，IFN-γ评分与增殖之间存在良好的相关性(图8)。结合来自癌症治疗反应门户网站数据库（The Cancer Therapeutics Response Portal database）的药物反应信息和肿瘤细胞系的基因表达谱信息，作者发现30种药物中有20种的敏感性与STAT1呈正相关。IFN-γ相关基因可能成为这些药物和癌症靶向治疗研究的目标。
图 8 不同恶性肿瘤中IFN-γ水平与14种不同功能状态的关系
肿瘤的纯度与IFN-γ水平有关
作者评估了33种不同类型的肿瘤，以确定IFN-γ评分之间的相关性，并发现在大多数癌症中，IFN-γ与M1和M2巨噬细胞、T细胞滤泡辅助细胞、激活的NK细胞和CD8 T细胞之间存在正相关。同时，IFN-γ评分与T细胞CD4 naïve和NK细胞休眠呈负相关(图9)。在肿瘤免疫评分分析中，发现在33个研究的肿瘤中，大多数肿瘤的IFN-γ评分与免疫细胞浸润程度呈正相关(P < 0.05，图10A)。
图 8 不同恶性肿瘤中IFN-γ水平与14种不同功能状态的关系
肿瘤的纯度与IFN-γ水平有关
作者评估了33种不同类型的肿瘤，以确定IFN-γ评分之间的相关性，并发现在大多数癌症中，IFN-γ与M1和M2巨噬细胞、T细胞滤泡辅助细胞、激活的NK细胞和CD8 T细胞之间存在正相关。同时，IFN-γ评分与T细胞CD4 naïve和NK细胞休眠呈负相关(图9)。在肿瘤免疫评分分析中，发现在33个研究的肿瘤中，大多数肿瘤的IFN-γ评分与免疫细胞浸润程度呈正相关(P < 0.05，图10A)。
图 9 IFN-γ评分与肿瘤浸润免疫细胞的相关性在33种不同的肿瘤中，IFN-γ评分与肿瘤浸润免疫细胞之间存在相关性。
对于PCPG、LUSC、PAAD、SARC、READ、KIRP、COAD、GBM、UCS、KICH、THYM、CHOL、LGG和ACC, IFN-γ评分与基质细胞评分呈正相关(图10B)。此外，IFN-γ评分与ACC、SKCM、UVM、THCA、SARC、UCS、KIRC、LGG、KIRP、TGCT、CESC、LIHC、BRCA、LUSC、KICH、LUAD、OV、LAML、READ、BLCA、MESO、HNSC、GBM、CHOL、COAD、UCEC、PAAD、PCPG、DLBC、PRAD、ESCA、STAD和THYM的TME评分均呈正相关(均P < 0.05，图10C)。上述结果提示IFN-γ与肿瘤的免疫状态密切相关。
图 10 IFN-γ评分与肿瘤纯度的相关性分析。
IFN-γ评分与免疫相关基因的关系
为了研究IFN-γ在免疫调节中的作用，作者研究了在人类恶性肿瘤中IFN-γ评分和ICG的存在之间是否存在相关性。IFN-γ评分和ICG之间的关联结果表明，几乎所有被调查的不同癌症的IFN-γ评分都与TIGIT、IDO1、ICOS、CD86、CTLA4、HAVCR2、PDCD1LG2和CD48的表达呈正相关(图11A)。进一步，作者分析了23个免疫抑制基因与IFN-γ评分的相关性。几乎在所有评估的癌症类型中，LAG3、TIGIT、CD96、IDO1、PDCD1、HAVCR2、CTLA4、PDCD1LG2、CD244和CD244的表达水平与IFN-γ评分呈正相关。在13个肿瘤中，IFN-γ评分与VTCN1表达呈负相关，而在16个肿瘤中，IFN-γ评分与KDR表达呈负相关(图11B)。在32种不同的肿瘤中，IFN-γ评分与CD86、CD48、KLRK1、LTA、CD27、TNFSF13B、TNFRSF9、CD40LG、KLRC1、IL2RA和CD80密切相关(P均< 0.05，图11C)。同时，作者探讨了IFN-γ评分与趋化因子之间的关系。结果显示IFN-γ score与CCL5、CXCL11、CXCL9、CXCL10、CCL4、CXCL13、CCL3、CCL8和CCL2趋化因子基因表达之间存在正相关(图11D)。IFN-γ评分与趋化因子受体基因CXCR6、CCR1、CCR5、CCR2、CXCR3呈显著正相关，与CXCR2、CCR1、CCR9呈显著负相关。作者的结果与先前的研究一致，免疫检查点基因(immune checkpoint genes, ICGs)在调节免疫细胞浸润和免疫治疗方面发挥着显著的作用。
图 11 IFN-γ水平与免疫相关基因的关系
IFN-γ评分与免疫治疗反应指标的相关性
免疫治疗的结果可以通过监测肿瘤的免疫逃逸过程来预测。对于大多数癌症，作者观察到IFN-γ评分和TMB之间的良好相关性。TMB与PCPG、OV、LGG、LUSC、PRAD、THCA、LAML、COAD、ESCA、SARC、LIHC、CESC、BRCA、KIRP、MESO、PAAD、SKCM、BLCA、KIRC、UCEC、HNSC、KICH、LUAD和UCS的IFN-g评分密切相关(均P<0.05，图12A)。此外，作者研究了IFN-γ评分是否与MSI相关。较高的IFN-γ评分与GBM、ACC和BRCA中较低的MSI患病率相关(均P<0.05，图12B)。TIDE评分，如TMB和PD-L1，是预测ICB治疗效果的常用指标之一。TIDE评分升高的患者ICB反应较低，因为这些患者肿瘤免疫逃逸的风险增加。在对22例癌症的检查中，TIDE和IFN-γ评分之间的相关性在所有22例肿瘤中均为负相关。这为进一步研究IFN-γ相关基因是否可作为ICB治疗的潜在标志物和免疫检查点抑制治疗的调节因子提供了基础。
图 12 人类恶性肿瘤中与IFN-γ相关的免疫治疗反应指标
KIRC肿瘤微环境中IFN-γ的单细胞转录组分析
Seurat进行质量控制，选择13124个高质量的单细胞转录组数据进行进一步分析。如通过基于tSNE的细胞聚类分析所确定的，上述细胞可以被分类为11组：单核细胞1、单核细胞2、KIRC 1、KIRC 2、KIRC 3、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞（图13A）。标记基因表达在不同细胞类型之间的差异非常显著。作者还发现，来自两个独立KIRC样本的癌细胞聚在一起成为同一簇(KIRC3)，以及许多其他不同的簇(KIRC1和KIRC2)。以上结果显示了KIRC细胞类型内的异质性(图13B)。为了评估不同细胞类型中IFN-γ评分的差异，作者进行ssGSEA来总结KIRC TME中IFN-细胞评分。值得注意的是，作者发现不同细胞间IFN-γ评分存在显著差异(图13C)。KIRC细胞IFN-γ评分最低，提示该标记物比肿瘤本身更准确地代表TME。IFN-γ评分在KIRC细胞亚群间差异显著，表明IFN-γ表达是KIRC细胞的潜在特征(图13D)。由此可见，在KIRC TME的不同细胞间IFN-γ存在显著差异。因此，靶向IFN-γ可能代表了TME调控的重大进展。
图 13 干扰素-g在KIRC肿瘤微环境中的作用。
结论
本文介绍了IFN-γ在不同肿瘤中的泛癌分析。此外，作者对未来的肿瘤免疫治疗提出了新的概念和观点，强调了IFN-γ在未来的肿瘤免疫治疗中的潜在用途和应用方向。
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