测序原理

HiFi测序原理

PacBio测序即单分子实时测序，其原理是：当DNA与聚合酶形成的复合物被ZMW（零模波导孔）捕获后，4种不同荧光标记的dNTP通过布朗运动随机进入检测区域并与聚合酶结合，与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留的时间。因此，统计荧光信息存在时间的长短，可区分匹配的碱基与游离碱基。通过统计4种荧光信息与时间的关系图，即可测序DNA模板序列。

HiFi 与CLR 比对

PacBio平台有CLR和HiFi两种测序模式。

CLR测序模式称为超长测序模式（插入片段30kb以上），产生的数据是基于单循环测序的结果，一次插入片段只测序一次，准确度和PacBio常规测序保持一致，在85%左右。CLR测序可以利用自身的数据进行纠错，当数据深度达到50X左右时，一致性序列准确性超过99.999%（QV50）。

HiFi的准确度超过Q20（99%），并且还能兼顾超过10kb，甚至可达20kb的长读长测序模式。由于HiFi插入片段只有10-20kb, 因此测序时酶会绕着DNA模板（插入片段）进行滚环测序，即插入片段会被多次测序。这样单词测序中造成的随机测序错误，可以通过算法进行自我纠错校正，最终得到高精度的HiFi Reads。