• 官网教程：外周血单个核细胞数据集 Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC)
• 可以从这里下载 PBMC 测试数据集，把下载文件存放在 Data 目录下

创建 Seurat 对象

library(dplyr)
library(Seurat)
library(patchwork)

# 加载 PBMC dataset
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "Data/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
# 初始化 Seurat object with the raw (non-normalized data).
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
pbmc
#An object of class Seurat 
#13714 features across 2700 samples within 1 assay 
#Active assay: RNA (13714 features, 0 variable features)

查看 Seurat 对象

# 查看三个基因在前30个细胞中的数据

pbmc.data[c("CD3D", "TCL1A", "MS4A1"), 1:30]
## 3 x 30 sparse Matrix of class "dgCMatrix"
##        [[ suppressing 30 column names ‘AAACATACAACCAC-1’, ‘AAACATTGAGCTAC-1’, ‘AAACATTGATCAGC-1’ ... ]]                                                            
## CD3D  4 . 10 . . 1 2 3 1 . . 2 7 1 . . 1 3 . 2  3 . . . . . 3 4 1 5
## TCL1A . .  . . . . . . 1 . . . . . . . . . . .  . 1 . . . . . . . .
## MS4A1 . 6  . . . . . . 1 1 1 . . . . . . . . . 36 1 2 . . 2 . . . .

标准预处理工作流程

These represent the selection and filtration of cells based on QC metrics, data normalization and scaling, and the detection of highly variable features.

质量控制和标准化

1. 标记线粒体基因

将“MT-”开头的基于当作线粒体基因，并计算百分比：

pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
head(pbmc@meta.data, 5)
##                  orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt
## AAACATACAACCAC-1     pbmc3k       2419          779  3.0177759
## AAACATTGAGCTAC-1     pbmc3k       4903         1352  3.7935958
## AAACATTGATCAGC-1     pbmc3k       3147         1129  0.8897363
## AAACCGTGCTTCCG-1     pbmc3k       2639          960  1.7430845
## AAACCGTGTATGCG-1     pbmc3k        980          521  1.2244898

2. 过滤数据

可视化 QC 指标，并使用它们来过滤细胞

VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2

观察图片，选择一个过滤标准，把握不准的话，也可以使用下面标准过滤试试：
如果从上一步生成的图中看到有很多细胞偏离正常范围，也可以根据图来定范围

• 保留 nFeature_RNA大于200、小于2500的细胞
• 保留 percent.mt 小于 5 的细胞

# 这一步是过滤步骤
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)

# 可以用上面的代码画图检查

3.标准化

我们使用一个全局缩放标准化方法“ LogNormalize”，该方法对基因 的表达以总表达量来标准化，将其乘以一个比例因子(默认为10,000) ，并对结果进行 log-transforms。

• 经过标准化了的表达值存储在 pbmc[[“ RNA”]]@data 中；
• 原始的 count 数据存储在 pbmc[[“ RNA”]]@count 中，NormalizeData函数利用这里的数据进行标准化
• 因此不用担心重复运行 NormalizeData 函数会导致重复标准化的问题

pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
# 上面的参数都是默认的，等同于下面：
# pbmc <- NormalizeData(pbmc)