这是 Adimab 公司 2016年的文章，对当时2 期、3 期临床试验和已获得 FDA 批准的几乎全部抗体药物的 12 种生物物理特性进行了全面分析，并对这些指标建立了红色警告的阈值，该工作对与筛选 leading 抗体提供了参考。
除了与目标靶分子结合外，所有抗体药物还必须满足一系列标准，包括生产可行性、储存稳定性和无脱靶粘性。这组特性通常称为 “developability”。文章在此对已在 2 期或 3 期临床试验和已获得 FDA 批准的几乎全部抗体药物的这些特性进行了全面分析。结果显示，该组中的许多药物或候选药物都存在重大 developability 风险；然而，随着批准的推进，此类红色警告信号的数量会减少。该参考数据集有助于确定未来候选药物的开发优先级。
1 摘要
随着抗体发现和优化技术的不断进步，大大增加了找到所需生物特性分子的机会；然而，“成药性” 作为一项额外要求，越来越受到关注。文章试图量化 “developability” 的多种生物物理指标的历史可接受性极限值。文章收集了 137 种处于临床晚期抗体的氨基酸序列，其中包括 48 种获准用于治疗的抗体，并用于构建同种型匹配的 IgG1 抗体，然后在哺乳动物细胞中表达。每一种源抗体采用十几种生物物理特性进行评估。观察到的指标的分布用于经验性地定义类药物可行性的边界，这可以作为未来抗体候选药物的实用指南。
2 引言
靶标结合是任何药物开发中首要考虑的问题。然而，一旦先导分子达到所需的生物效力，一套称为 “developability” 的特性就变得至关重要。对于单克隆抗体，这些特性包括高表达量、高溶解度、共价完整性、构象和胶体稳定性、低多特异性和低免疫原性。在药物开发的后期阶段，如果未能满足任何这些标准，付出的代价将非常高昂，因此人们付出了巨大的努力，根据序列基序和实验相关的生物物理特性来预测 developability。
在一项小分子药物研究中，研究人员收集并计算分析了 2,000 多个已在美国批准并具有口服可用性小分子。研究人员制定了一组简单的阈值，即 “Lipinski rule of fives”，将其用于确定进入临床开发的小分子的优先次序。迄今为止，尚未出现类似的抗体药物指导原则，文章目的是建立这样的准则。与 Lipinski 的工作类似，文章首先收集了至少已进入 2 期试验并具有 USAN 或 WHO 国际非专利名称 (INN) 名称的抗体序列（截至本项目开始共有 137 个）。为了方便抗体可变区能相互比较，文章将每种抗体表达为人类 IgG1 同种型，并使用相同的 Hepes 缓冲盐水中进行配置。然后对每种抗体进行 12 种不同的生物物理测定，这些测定通常用于developability评估。
出乎意料的是，许多指标的数值分布并非对称高斯分布，而是长尾分布，几种抗体的数值明显高于平均值。由于文章研究中所有抗体均已开发至第 1 阶段之后，这一结果表明，许多当前可用的指标可能存在错误预测开发失败的倾向。然而，根据开发阶段对数据集进行分层分析发现，对于开发进度最快的分子，此类“危险信号”（定义如下）的数量会减少，而获批的抗体的警告数量趋于减少。
3 结果
3.1 抗体药物的序列特征
为了在共同背景下比较抗体可变区的性质，所选的 137 种抗体组被表达为人类 IgG1 同型抗体（allele *01），并根据需求使用 kappa 和 lambda 的标准恒定区（等位基因分别为 IGKC*01 和 IGLC2*01）。通过这种实验设计，可以严格基于可变域差异进行比较。众所周知，完美复刻生物药物非常复杂，并且已经出现了一个专门从事这项任务的领域，称为生物仿制药开发。创建 130 多种生物仿制药显然超出了这项工作的预期范围。但是，通过本研究报告这些已发布序列的数据，可以使其他人能够复制结果并进行自己序列/功能的相关性分析。
本研究选定的抗体列于数据集 S1中；48 种抗体是临床批准抗体（其中两种迄今仅在美国以外地区批准）的可变区序列构建的，42 种处于 3 期或 2/3 期阶段，其余 47 种处于 2 期。总共 124 种具有 κ 轻链，13 种具有 λ 轻链。58 种被归类为“全人源”（带 -UMAB 后缀），67 种被归类为“人源化”（带 –ZUMAB 后缀），12 种至少有一个“完全”非人类可变区（–XIMAB、–XIZUMAB 或 –MONAB 后缀）。这些抗体的可变区序列显示在 数据集 S2 中。
检测方法的简单介绍
选择检测试剂盒的标准有两个：首先，该试剂盒有文献用于治疗性抗体表征，或者是一种常用的检测试剂盒（例如滴度）。其次，该检测试剂盒可以表征数百种抗体，并且每份检测试剂盒消耗的材料不到 1 毫克。本研究中使用的抗体的实验测量结果显示在数据集 S3 中。
为了方便以后查找，对十几种生物物理特性的方法做简单的汇总：
1 HEK Titer (mg/L)：通常指的是在HEK（人类胚胎肾细胞）细胞系中表达的蛋白质或病毒颗粒的浓度。测定HEK Titer可以帮助了解在这些细胞中表达的目标蛋白或病毒颗粒的数量，从而评估表达系统的效率。
2 Fab Tm by DSF (°C)： 用DSF（差示扫描荧光法）方法测定的 Fab 区域的Tm值。
3 SGAC-SINS AS100 ((NH4)2SO4 mM)： 盐梯度亲和捕获（salt-gradient affinity-capture self-interaction ）和纳米粒子光谱学（nanoparticle spectroscopy），以检测和量化蛋白质在不同条件下的自相互作用。这对于理解抗体的聚集倾向及其稳定性非常重要。
4 HIC Retention Time (Min)a： Hydrophobic Interaction Chromatography 疏水相互作用色谱HIC，这种方法依赖于蛋白质表面的疏水性区域与色谱介质（树脂）中的疏水基团之间的相互作用。HIC特别适合于分离具有不同疏水性特征的蛋白质，因此它常被用来纯化和分析抗体。在抗体的生产和表征中，通过测量HIC保留时间，可以评估抗体分子的疏水性特征，这对于理解其行为、稳定性和可能的聚集倾向至关重要。
5 SMAC Retention Time (Min)a： Standup Monolayer Adsorption Chromatography 立式单层吸附色谱，是一种较不常见的色谱技术，专门用于分析和纯化大分子，如抗体。SMAC 保留时间反映了蛋白质或抗体与色谱介质上的单层分子之间的相互作用强度。更长的保留时间表明抗体与固定相之间有较强的相互作用，通常与抗体的特定区域（如疏水区或特定的功能结构域）高度匹配。
6 Slope for Accelerated Stability： “加速稳定性斜率”通常指的是在药品、生物制剂（如抗体）或其他化学产品的加速稳定性测试中计算出的一个值。斜率越陡，表示在加速条件下降解更快。
7 Poly-Specificity Reagent (PSR) SMP Score (0-1)： Poly-Specificity Reagent(PSR) “多特异性试剂” 特制的混合物，通常包含多种小分子、肽或蛋白质，用来模拟人体内复杂的生物环境。这种评估方法可以帮助研究人员识别和筛选出倾向于与多种不同靶点结合的抗体，这种特性可能导致药物副作用或减少药物的有效性。SMP Score 范围从0到1。分数越低，表示抗体的特异性越高，与非目标分子的交互作用越少，从而预期副作用更少。高SMP分数可能表明抗体具有较高的多特异性，可能需要进一步改进或筛选以降低这种属性。
8 Affinity-Capture Self-Interaction Nanoparticle Spectroscopy (AC-SINS) ∆λmax (nm) Average： 亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱法，用于检测和分析抗体或其他蛋白质分子的自我相互作用。这种技术通过使用纳米粒子和特定的亲和捕获方法来研究蛋白质在溶液中的聚集行为，这对于药物开发中确保蛋白质疗效和安全性至关重要。∆λmax (nm): 这个参数代表了在AC-SINS实验中观察到的纳米粒子吸收光谱中的最大波长偏移。当蛋白质（如抗体）在溶液中聚集时，与纳米粒子的相互作用会导致纳米粒子吸收峰的波长发生变化。这种波长的偏移（∆λmax）是由于蛋白质聚集体的形成改变了纳米粒子的局部环境和光学性质。
9 CIC Retention Time (Min)： Cross-Interaction Chromatography 交叉相互作用色谱，是一种专门用于分析蛋白质间交互作用的色谱技术，尤其适用于评估抗体或其他生物分子的相互作用。这种方法通过模拟生物体内的环境条件，可以非常有效地揭示蛋白质如何在复杂体系中相互作用，从而对药物的安全性和有效性进行预测。CIC保留时间能够显示抗体与其他蛋白质或可能的抗原之间的结合力和稳定性。
10 CSI-BLI Delta Response (nm)： 是一种利用生物层干涉技术来评估克隆抗体自身相互作用的方法。这种技术通过测量抗体在特定条件下与自身或其他分子的结合亲和力来探索其可能的聚集倾向，对于开发高效且稳定的治疗性抗体尤其重要。CSI-BLI及其Delta Response是分析抗体自我相互作用和聚集倾向的关键技术和指标，对于确保抗体疗效和安全性具有重要价值。
11 ELISA：酶联免疫吸附测定（ELISA）技术。
12 BVP ELISA： 使用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术来检测和量化杆状病毒颗粒的存在和浓度的一种方法。
3.2 生物物理特性是长尾分布
1、Fig1 显示了137个单抗的12种生物物理特性的分布图，箭头方向代表不利的指标方向。这些成功克服了高表达、制剂和 I 期临床试验等诸多困难的分子，预期本应该具有良好一致的生物物理特性。然而，对于大多数指标，文章发现情况并非如此，有一小部分分子在一个或多个指标中表现出异常不利的值。
2、之前文献已经表明 PSR 值与小鼠的药代动力学 (PK) 有很好的相关性。超过一定阈值（对应到本文为 PSR值 > 0.25 ），药物在小鼠体内清除速度会更快。137 种抗体中，有 33 种的 PSR 值高于阈值，非特异性粘性值超标。
3、虽然一些不利的生物物理值指标并不代表最终临床的失败，但是任何一个不利值都可能对药物开发造成一些困难。也有一些药物药代动力学的负面影响可最终导致临床失败的案例。
4、静脉给药仍然在批准的药物组合中占主导地位，对高浓度的要求较低，因此可能对次优聚集性能更宽容。此外，靶标介导的清除（而不是FcRn、非靶标介导的清除）更能主导患者的整体 PK。
3.3 生物物理特性值的聚类分析
1、 对这十几个指标进行了无监督聚类，主要分为五类：(PSR、CSI、AC-SINS、CIC)、(SGAC100、SMAC、HIC)、(ELISA、BVP)、(AS) 和 (HEK titer、Tm)，如Fig1A 所示。 Fig1B显示了指标之间的 Spearman 相关性。
2、细胞培养表达滴度HEK titer 与热力学状态变量 Tm 的相关性最为密切。HEK 滴度与抗体序列的表达相关，它与 Tm 的相关性也在其文献中有报道。
3、不同于热力学稳定性 (HEK 滴度，Tm)、疏水相互作用 (SGAC100、SMAC、HIC)、长期聚集倾向 (AS) 或 ELISA 板结合 (ELISA、BVP)等性质，最大的簇 (PSR、CSI、AC-SINS、CIC)表示的是蛋白质结合检测方法的一种共同特性，交叉相互作用或者自相互作用。
3.4 阈值警告标记
1、根据 Lipinski 阈值标记方法，选择已批准药物中最差 10% 的截止值作为警告信号阈值，如 Table1所示。分析不同开发阶段抗体的警告信号数量，随着临床和审批的递进，警告信号逐渐减少。已批准药物的警告信号最少，65% 没有任何警告信号 如Fig3A 所示。
2、Fig3B 也显示了 (PSR、CSI、ACSINS、CIC)组 和 ( ELISA、BVP) 组阈值警告信号在已审批通过药物和临床药物中的统计差异。
3、之前有文献报导通过噬菌体展示技术发现的抗体可能显示出不利的生物物理特性。这与文章数据集中的结果一致，通过噬菌体展示获得的抗体标记数量明显高于来自哺乳动物来源的抗体，如Fig3C所示。
3.5 按属性集进行抗体聚类
1、使用生物物理特性数据计算抗体之间的成对距离，并进行聚类，如Fig4 所示。其中明显分为五个不同簇相对应的矩形。两个最大的簇分别由 80 种和 22 种抗体组成。最大的簇表现出更普遍有利的生物物理特性，这个“干净”的簇包含文章数据集中 48 种获批抗体中的 34 种。获批抗体、phase3、phase2阶段抗体分别用红色、棕色、绿色表示。
4 参考文献
[1]Biophysical properties of the clinical-stage antibody landscape[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017.
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