感谢小学学！
测序原理：
将基因打断成片段reads；每段reads一端连接不同的UMI做为标识；PCR；测序
uniquely mapped reads：reads的唯一性由UMI和map位置共同确定
PCR duplicates：pcr后，UMI相同且map位置相同的reads会扩增很多条，去duplicates就是，仅保留一条，去除由于PCR效率不同导致的差别
基因表达量=sum（去除duplicates后的uniquely mapped reads）
expression A = read1 + read2 +read3
expression B = reada + readb +readc +readd +reade
影响分析的因素：
文库大小的影响：文库越大，细胞越多，含有的geneA绝对值就越多
基因长度影响：基因越长，打断后的reads就越多，相加值就越大
测序深度影响：相当于PCR效率不同带来的影响
为什么要PCR：对于chipseq、singlecellseq、atacseq细胞量少，测序时信号非常低，无法检测到，送测前PCR是为了扩大信号。
去duplicates是去除PCR的影响，效果相当于收获样本打成片段后直接测序。
去除文库大小影响，就是去除不同批次收样细胞量不同的影响，效果相当于每次都收获相同量的细胞进行测序
常规RNAseq数据标准化步骤：
counts矩阵，行为sample，列为gene
方法1：
exprSet=mean(colSums(exprSet))*exprSet/colSums(exprSet)
exprSet=log2(exprSet+1)
方法2：TMM（edgr+limma包）
注意：（1）方法1结果全为正，方法2会出现负值；（2）方法1中，当不同批次送样，或同批次但不同lane（没有混样）时需要消除批次效应（具体步骤上网找。方法2包含了去批次处理，不需再去批次。
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