腺病毒疫苗促进肿瘤新生抗原特异性CD8+ T细胞的干细胞特性和肿

文献链接：Adenoviral-based vaccine promotes neoantigen-specific CD8+ T cell stemness and tumor rejection
发表期刊：SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE
影响因子：19
发表时间：2022年8月
单细胞转录组测序用于 临床前/I期--药效评估与安全性机制研究
该临床试验已经推进到I/II期，招募微卫星不稳定的实体瘤患者：Nous-209 Genetic Vaccine for the Treatment of Microsatellite Unstable Solid Tumors

1. GAd疫苗设计和新表位稳定性验证

作者选择了7个预测的免疫原性新表位（来自小鼠MC38结直肠腺癌细胞系的肿瘤特异性点突变：Cpne1、Irgq、Aatf、Reps1、Med12、Dpagt1、Adpgk）生成一种针对肿瘤特异性新抗原的Ad疫苗（图1A）

与相应的野生型肽相比，这些肽对主要组织相容性复合体I类（MHC-I）具有最高的结合亲和力，稳定性测试显示：Reps1的稳定性最高，其次是Cpne1和Adpgk（图1 B-D）

图1.GAd疫苗设计和稳定性验证；图A. 腺病毒载体设计图：7个新表位头到尾连接，生成一个合成的抗原分子；图B-D. 免疫原性肽的稳定性测试：在RMA-S细胞系中装载新抗原多肽后，通过与MHC-I分子组合在细胞表面表达，然后通过流式细胞术在不同时间段定量

2. 小鼠模型评估评估GAd疫苗和PD-1联合使用有效性

试验设计1：设置3组注射MC38结肠腺癌细胞系的C57BL/6J雌性小鼠（G1-G3），从第11天开始G2和G3组小鼠每3天注射一次单克隆抗体PD-1（第11天肿瘤大小在70-100立方毫米），G3组同时在第11天注射多种新抗原GAd疫苗，在肿瘤植入第26天，通过流式细胞术分析引流淋巴结、肿瘤和脾脏中的Adpgk+和Reps1+的CD8+ T细胞（图2A）

2.1 GAd治疗扩大肿瘤中的新抗原特异性CD8+ T细胞

两个新表位（Adpgk和Reps1），在稳定性、预测的结合亲和力和体内免疫原性方面具有非常相似的特征，具有不同的浸润肿瘤的能力：

• 生存率分析：与PD-1单药治疗相比，接受GAd和αPD-1联合治疗的小鼠的抗肿瘤控制增强，总生存率增加（图2B）
• Reps1+ T细胞：Reps1是一种在肿瘤排斥反应中效率较低的新表位，在未治疗的对照组荷瘤小鼠中，Db -Reps1+ CD8+ T细胞的频率非常低（图2 C），但仅在脾脏中Db -Reps1+ CD8+ T细胞的频率和数量均显著增强（图2I），引流淋巴结和肿瘤组织中没有显著差异（图2 E,G）
• Adpgk+ T细胞：Adpgk是之前研究发现在肿瘤组织浸润T细胞扩增较明显的表位，GAd +αPD-1处理的荷瘤小鼠引流淋巴结、肿瘤和脾脏中Db -Adpgk+ CD8+ T细胞的频率增加（图2 D,F,H），同时在GAd免疫联合αPD-1抗体治疗的小鼠与单独接受αPD-1治疗的小鼠相比，肿瘤和脾脏中Db -Adpgk+ CD8+ T细胞的数量分别为单独治疗的100倍和10倍。
  图2. GAd疫苗联合PD-1治疗通过增加小鼠肿瘤新抗原反应性CD8+ T细胞的数量来控制肿瘤生长；图A. 试验设计；图B. G1-G3中荷瘤小鼠的总生存率；图C. G1-G3中荷瘤小鼠的肿瘤新抗原特异性T细胞的流式分析图；图D-I. Adpgk和Reps1阳性CD8+ T细胞在引流淋巴结、肿瘤和脾脏中的百分比

2.2 GAd治疗增加了新表位特异性记忆前体和效应体的频率（流式分析）

GAd免疫联合αPD-1免疫后，在荷瘤小鼠中，新抗原特异性CD8+ T细胞的免疫原性增强，分化和扩增的途径不同。引流淋巴结和脾脏中有更多的记忆前体细胞，肿瘤中有效应T细胞：

CD127+ KLRG1−：记忆前体
CD127+ CD62L+ KLRG1−：中央记忆
CD127−KLRG1+：短暂效应
CD103+ CD69+ ：组织常驻记忆
PD-1+ CD38+ ：耗竭特性

• 记忆前体T细胞：在引流淋巴结、肿瘤和脾脏中，用GAd处理的荷瘤小鼠中，检测到CD127+KLRG1−记忆前体数量的增加（图3 A-D；绿色标记）
• 效应T细胞：CD127−KLRG1+Db-Adpgk-特异性CD8+ T细胞（效应体）也发现在引流淋巴结、肿瘤和脾脏显著增加，尤其在肿瘤和脾脏组织中，是αPD-1单药治疗的10倍（图3 A-D；蓝色标记）

图3. GAd联合PD-1治疗诱导小鼠新表位活性记忆前体CD8+ T细胞；图A. CD127（记忆前体）和KLRG1（效应体）标记物的流式分析图：绿框为记忆前体，蓝框为效应体；图B-D. 记忆前体和效应因子数量分析：绿色表示记忆前体，蓝色表示效应体；

• 耗竭T细胞：肿瘤组织中的记忆前体T细胞进一步分析“耗竭特性”，发现GAd处理的荷瘤小鼠中PD-1和CD38双阳性细胞的频率和数量增加（图3 E），而引流淋巴结中的频率和数量较低（图3 E至H），尤其在下游淋巴结中低于αPD-1治疗组（图3F）；在肿瘤组织Db-Adpgk+CD127−KLRG1+和CD127−KLRG1−CD8+的T细胞亚群（图3I)，GAd处理组大约58%和70%的细胞同时表达PD-1和CD38，但仅在CD127−KLRG1−CD8+ 亚群中检出耗竭T细胞相对其他组显著增加（图3K）

• 组织常驻记忆T细胞：CD103+ CD69+ TRM CD8+ T细胞的频率在GAd处理组显著增加（图3 L,M）

图3. GAd联合PD-1治疗诱导小鼠新表位活性记忆前体CD8+ T细胞；图E. CD127+KLRG1−Db -Adpgk+ CD8+ T细胞的CD38和PD-1标记物分析；图F-H. 在引流淋巴结(F)、肿瘤(G)和脾脏(H)中检测CD127+ Db -Adpgk+ CD8+ T细胞门控的CD38+ PD-1+细胞的数量；图I. 在肿瘤组织，门控CD127−KLRG1+（左）和门控CD127−KLRG1−（右）Db-ADpgk+CD8+T细胞上耗尽的CD38+ PD-1+细胞百分比；图J. 检测肿瘤中在门控CD127−KLRG1+上耗尽的Db -Adpgk+ CD8+ T细胞的数量；图K. 检测肿瘤中在门控CD127−KLRG1−上耗尽的Db -Adpgk+ CD8+ T细胞的数量；图L. 肿瘤中CD103和CD69标记物（CD103+ CD69+ TRM组织驻留记忆T细胞）的细胞比例分析；图M. 检测肿瘤中Db -Adpgk+ CD8+ TRM细胞的数量

3. 小鼠模型--单细胞转录组测序数据分析汇总（scRNA-seq）

试验设计2：3组小鼠（G1-G3）植入MC38肿瘤后第17天开始，G2和G3分别接受不同的药物处理，并在第27天收集3组小鼠淋巴结和肿瘤组织，流式分选得到的CD8+Adpgk+细胞用于Smart-seq2测序；未作处理的小鼠作为对照标记为CTRL

单细胞测序质控分析： CTRL组（9个重复）-157 cells；αPD-1组（5个重复）- 226cells；αPD-1+GAd组（8个重复）- 749cells，UMAP分出7个亚群（图4B,C），每个亚群的marker表达如图4E-G

3.1 GAd治疗增加了新表位特异性干细胞样和效应细胞积累（细胞组成分析）

联合治疗αPD-1+GAd促进了Db -Adpgk+ CD8+ T细胞在淋巴结中分化为TSTEM前体和肿瘤中的效应亚群（图4H,I）：

• 联合GAd处理组：淋巴结显著富集干细胞样祖细胞（cluster5-69%）；肿瘤组织显著富集耗竭T细胞（cluster4-44%）和效应T细胞（cluster3- 19%）
• αPD-1处理组：淋巴结显著富集早期激活T细胞（cluster6-64%）
• 未治疗组：淋巴结显著富集幼稚T细胞（cluster2-55%）

图4. CD8+ T细胞的scRNA-seq鉴定了由PD-1+GAd疫苗在小鼠中诱导的细胞亚群差异；图A. scRNA-seq的实验设计；图B. CD8+ T的 UMAP可视化图（t-肿瘤；ln-淋巴结；dln-引流淋巴结）；图C. 对图B根据表型做注释；图D. 各实验条件下Db -Adpgk+ CD8+ T细胞频率的分布：不同颜色表示不同cluster；
图4. CD8+ T细胞的scRNA-seq鉴定了由PD-1+GAd疫苗在小鼠中诱导的细胞亚群差异；图E. 编码转录因子、记忆性相关marker、效应性marker、免疫检查点marker的基因表达量分析；图F. 图E中的marker基因表达量映射到UMAP细胞分群图：颜色表示对应表达marker gene数量；图G. 差异基因表达热图；图H. 不同治疗方法的细胞比例聚集式热图：横轴表示图C中不同cluster，纵轴表示不同治疗方法和取样部位；图I. 以H图为基础仅显示高占比亚群：圆圈大小表示细胞占比差异显著性，颜色深浅表示差异倍数值

3.2 GAd治疗改变T细胞分化轨迹并诱导CD8+干细胞样前体生成（拟时序分析）

- 不同cluster特性分析： 幼稚T细胞cluster2 中TCF7+干细胞样前体标签基因显著富集（记忆性，耗竭性，效应性功能反之）；效应T细胞cluster3 中效应与记忆特征标签基因显著富集（耗竭性反之）；耗竭T细胞cluster4 中显著富集耗竭标签基因；干细胞样前体T细胞cluster5 显著富集记忆性和效应性标签基因；早期激活T细胞cluster6 表现出衰竭、记忆和效应特征的负富集；在记忆T细胞cluster7 TCF7+肿瘤浸润、T细胞干性前体、循环记忆T细胞标签相关基因显著富集，而效应性标签负富集（图5 A,B）

图5. 小鼠Db-Adpgk+ CD8+ T细胞的表型状态和分化轨迹：图A. 不同cluster差异表达基因的GSEA热图；图B. 不同 gene signatures在各细胞亚群中表达百分比；

• GAd联合治疗驱动T细胞向干细胞样前体，记忆型，效应型T细胞轨迹分化：通过监督轨迹分析出3个以幼稚T细胞cluster2为起始的不同分化轨迹（图5 C），不同处理组在3条轨迹中的占比如图5D，每条轨迹的marker表达如图5E，GAd处理小鼠的Db -Adpgk+ CD8+ T细胞在轨迹2和轨迹3占比最高
  -- 轨迹1（360 cells）：幼稚T细胞-->激活T细胞
  -- 轨迹2（548 cells）：早期活性T细胞-->效应T细胞-->耗竭T细胞，伴随效应和免疫检查点抑制相关基因高表达
  -- 轨迹3（561 cells）：记忆T细胞-->干细胞样前体T细胞-->耗竭T细胞（记忆性和转录性marker瞬间高表达，免疫检查点和效应性marker表达增加缓慢）

图5. 小鼠Db-Adpgk+ CD8+ T细胞的表型状态和分化轨迹：图C. 拟时序轨迹分析；图D.不同处理组小鼠细胞在对应拟轨迹的细胞占比；图E. 转录因子、记忆、效应因子和检查点标记基因沿着3条分化轨迹的表达状态曲线：不同颜色的线条表示不同分化轨迹，横轴表示从幼稚型T细胞到耗竭T细胞的分化时间

3.3 GAd联合治疗可诱导更广泛的多功能CD8+ T克隆型（TCR-analysis）

总计检出330个 unique clone 和 34个 扩增型 clone：

• 扩增型clone占比沿分化轨迹增加：幼稚T细胞-->早期激活T细胞-->效应T细胞-->耗竭T细胞（不同cluster中的克隆多样性分布如图6B）
• 不同处理组的TCR模式显著不同： GAd疫苗处理小鼠的扩增型Db -Adpgk+ CD8+ T细胞克隆的数量最高（如图6C）
• 不同处理组的淋巴结和肿瘤TCR对比模式不同：αPD-1处理组中肿瘤和淋巴结共享克隆型比例高达86%，GAd联合处理组共享比例65%（如图6D,E），两种组织中高频率拷贝的共享TCR克隆型映射如图6F

图6. 小鼠淋巴结和肿瘤中记忆型干细胞样祖细胞和耗竭细胞中TCR克隆型分析；图A. TCR size映射到Db -Adpgk+ CD8+ T细胞UMAP分群图中的不同cluster；图B. 每个cluster中不同clone size的TCR分布饼图；图C. 不同实验组中TCR克隆分布条形图：举例CTRL（51TCR单拷贝），举例αPD-1+GAd,t（15种TCR多拷贝和71种TCR单拷贝，其条形图中不同的颜色块对应图例中的克隆编号+细胞数）；图D-E. 高频拷贝TCR在肿瘤和淋巴结中的频率分布散点图；图F. 不同TCR在UMAP分群图的投影；

• 多拷贝克隆型在不同处理组分布存在差异：αPD-1处理组小鼠中发现多拷贝TCR克隆主要富集在早期激活T细胞、耗竭型T细胞和干细胞样T细胞前体中；GAd联合治疗组则主要富集在干细胞样T细胞前体、效应T细胞和耗竭型T细胞；联合治疗使得效应T细胞群体（cluster3）TCR库显著扩大（图6G）
• GAd联合治疗组不同cluster的TCR多样性差异： 在GAd联合治疗组中，干细胞样T细胞前体（cluster 5）的TCR克隆频率与其他cluster存在显著差异（这与图5C中GAd联合治疗组显著在轨迹2和轨迹3富集的数据吻合）
  图6. 小鼠淋巴结和肿瘤中记忆型干细胞样祖细胞和耗竭细胞中TCR克隆型分析；图G. 多拷贝TCR在各cluster中的分布频率图：3个不同的panel表示不同分组，横轴表示不同cluster，纵轴表示对应TCR类别编号及拷贝数，颜色表示横轴所对应TCR在不同cluster中的比例（颜色越深；比例越高）；图H. αPD-1+GAd处理组小鼠的TCR细胞频率在各cluster中的分布

4. 临床I期实验分析

试验设计3：加入临床试验的患者首先接种GAd疫苗，随后通过3次MVA疫苗增强（两者都编码209个移码肽），整个过程中每3周接受一次αPD-1治疗，在特定时间点采集外周血（PBMC）7次通过体外酶联免疫吸附点（ELISpot）方法分析其对覆盖所有209 FSPs编码蛋白的16种肽pool的免疫原性，并针对不同的肽池分析患者的反应广度，采集穿刺样本2次进行RNA-seq。（详细参考图7A）
参与测试患者12人： dose1（3人）；dose2（9人）
临床反应： dose1队列的3例患者表现为部分缓解（PR）；dose2队列的4例患者表现为部分缓解（PR）；2例患者病情稳定（SD）；3例患者表现为阶段性进展（PD）；以上均未发现剂量毒性（图7B）

4.1 Nous209联合治疗获得持久的新表位特异性T细胞应答

- 疫苗免疫原性阳性率测试： dose1队列的阳性率为67%，dose2队列阳性率100%（图7C），相对基线接种前免疫原性显著提高（图7D）

图7. Nous-209疫苗接种在dMMR肿瘤患者中引起强烈而广泛的新抗原特异性T细胞反应；图A. 12例疫苗接种患者的临床事件时间轴（治疗包括PD-1联合GAd或MVA疫苗）；图B. 通过RECIST v1.1的肿瘤成像来评估的临床反应：白色的圆圈表示第一次反应时间，右侧箭头表示正在继续进行研究治疗（PR-部分缓解，SD-疾病稳定，PD-疾病进展）；图C-D. 通过体外检测IFN-γ衡量患者的免疫反应（16个覆盖整个疫苗序列的重叠肽池）
- 免疫原性广度分析：Pt3和Pt6分别为两种剂量队列的成员，患者对不同肽的免疫反应如图7E,F，能够看到疫苗诱导产生大量IFN-γ+ FSP-specific CD8+ T cells（图7G） 图7. Nous-209疫苗接种在dMMR肿瘤患者中引起强烈而广泛的新抗原特异性T细胞反应；图E-G. 免疫反应的广度：（E）16种肽的阳性比例饼图，（F）细胞内染色（ICS）后，通过流式细胞术检测各肽与PBMC结合量，（G） IFN-γ+ FSP-specific CD8+ T细胞定量

4.2 Nous-209疫苗诱导dMMR肿瘤患者新抗原特异性TCR克隆型扩大和多样化（RNA-seq）

采集穿刺样本的3位患者（Pt1, Pt11, Pt12）均为临床表现为PR患者，在Nous-209治疗后，TCR-β拷贝数增加，突出了克隆型的扩增和多样化（图8A），效应记忆T细胞的RNA相对丰度增加（图8B）。
验证疫苗诱导的CD8+ T细胞迁移性（外周血-->肿瘤），选择Pt1分析（其中引起该患者免疫应答的“突变肽”名为F24，在患者基线期和治疗期获得的肿瘤穿刺样本都有检测到对应突变）

• 疫苗接种后的患者外周血经IVS试验可以诱导特异性T细胞扩增：疫苗接种后Pt1血液中F24特异性CD8+T细胞比例增加（图8D左），外周血经过体外刺激（IVS）后，能够看到F24特异性CD8+T细胞显著扩增（图8D右）
• 外周血新表位特异性CD8+T细胞能够成功运输到肿瘤部位：在疫苗治疗后的肿瘤活检样本中检测到7个F24特异性CD8+T细胞克隆型与IVS试验(图8D右)相同的克隆型（图8E,F）
  图8. Nous-209疫苗接种后，TCR新抗原特异性T细胞克隆库得到扩大和多样化；图A. 3例有临床反应（PR）患者治疗前后肿瘤活检样本的TCR-β库的多样性比较：横轴表示TCR clone种类数，纵轴表示每种TCR的拷贝数；图B. RNA-seq数据中效应记忆T细胞mRNA比例；图C. 对患者1（pt1）的研究，患者现状为临床IV期-微卫星不稳定性高-结直肠癌-2L in PR，分别在第一次使用PD-1单抗前和治疗第八周（56天）取活检样本；图D. Pt1患者的T细胞反应测定：主要测定特异性肽F24，DNSO和CEFX分别为阴性对照和阳性对照，Ex vivo为PBMC无肽孵育的对照组，IVS为PBMC与F24孵育处理组；

图8. Nous-209疫苗接种后，TCR新抗原特异性T细胞克隆库得到扩大和多样化；图E. F24肽刺激疫苗注射前后PBMC的TCR-β克隆扩增柱状图；图F. 肿瘤活检组织的TCR-β克隆扩增柱状图：Baseline biopsy表示治疗前；图G. 治疗前后的肿瘤活检样本的TCR-β库的扩展和多样化分析