LA PCR时模板DNA的调制方法是怎么样的?

1LA PCR的反应条件是怎么样的?

 问＆答------------------------------------------- 

因扩增片段的大小、反应体积、使用扩增仪器的不同而不同。 

（1） 循环次数 根据模板DNA的量以及扩增片段的大小，设定25～30个循环。 如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，则会出现Smear。 

（2） Anneal以及Extension合适的Anneal温度通常在45～68℃之间 (预备实验可2℃间隔进行)。另外，由于LA Taq 在60～68℃间也有很高的活性, 因此可在此温度范围内设定Anneal-Extension温度, 进行2 Step PCR。Anneal-Extension温度为68℃ 时，每kbp大体可设定30秒～1分钟；当温度设定在68℃以下时, 时间设定可稍长一些。通常，Anneal温度太高，有时会得不到扩增产物；Anneal温度太低时，容易发生非特异性反应。另外，Extension时间太短时，会得不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优先生成；而Extension时间太长时，会出现Smear。

 2选择LA PCR引物 (Primer) 时的注意事项是什么? 

问＆答------------------------------------------- 

特异性非常重要。20mer左右的Primer, 如果特异性高，扩增20 kbp没有问题，但如果可能的话，建议设计30～35mer左右。使用特异性低的Primer时，会出现很多非特异性产物。 

3LA PCR时酶的使用量是多少? 

问＆答------------------------------------------- 

50 μl的反应体系可使用2.5 U的LA Taq。但合适的用量也与模板DNA的量及Complexity、扩增片段大小有关。酶量过多时，易发生非特异性反应，出现Smear；而酶量过少时，反应性能下降。 

4LA PCR时模板DNA的调制方法是怎么样的? 

问＆答------------------------------------------- 

模板DNA的质量是LA PCR成功与否的重要因素。扩增超过10 kb的DNA片段时，用简单的方法 (例如Cell只经过加热处理或Protease处理) 调制的DNA作模板不太合适， 建议使用充分精制的完整的DNA (没有Nick等)。

5是否可以对λ 噬菌体直接进行LA PCR反应?

 问＆答------------------------------------------- 

可以。99℃、10 min处理后的噬菌体约106～107 pfu作为模板，至少可扩增8 kb的DNA片段。 

6对Mammalian cell或E. coli 只进行热处理 (98℃， 2 min) 或Protease处理的样品可否进行LA PCR? 

问＆答------------------------------------------- 

（1）对E. coli只进行热处理可扩增10 kb的DNA片段 (50 μl PCR反应液中37℃ Overnight culture in L-both 使用2 μl)。 （2）Human细胞 (培养细胞) 如只经过热处理，可扩增数百bp；经过Protease处理、 热处理后的样品，最多可扩增1 ~ 2 kb。所以，如果要扩增长链DNA，建议使用经过充分精制的完整的DNA作模板。7对Mammalian cell或E. coli 只进行热处理 (98℃， 2 min) 或Protease处理的样品可否进行LA PCR?可以。使用LA Taq 及Ex Taq 时的PCR产物产生A的Overhang，与使用Taq 时的PCR产物克隆于T-vector 的效率基本相同。