今天继续分享" eQTLs play critical roles in regulating gene expression and identifying key regulators in rice "这篇文献，这里是最后的讨论和试验方法部分学习笔记。
讨论部分
这篇文章通过287份材料的转录组数据，鉴定出高质量的外显子变异体，根据表达数据发现，同一亚群的材料具有更多相似性，原因可能是每个亚群内存在特异表达基因。
和表型GWAS相同，eQTL分析也受到较大的连锁不平衡（LD）影响，从eQTL区间识别候选基因的过程很复杂。这篇文章中结合下游基因的共表达信息，确定关键调控因子。这些SNP之间是相互紧密连锁并影响下游基因的表达过程，调控网络略显复杂。
尽管eQTL区域的候选基因能够通过共表达和连锁不平衡来发现，但是构建全基因组的调控网络仍是难题。表型GWAS的QTL数量有限，相比之下，利用转录组表达数据和eQTL来识别候选基因更好，作者利用GWAS的数据结合转录组数据筛选候选基因。
TWAS和eQTL共定位识别到了GWAS遗漏的关键基因！由于转录组数据在时间（生长时期）和空间（采样位置）的特异性，它与表型数据的拟合程度是精细定位的关键。
作者在全基因组eQTL鉴定中，共发现了17个近端eQTL热点区和96个远端eQTL热点区，然后选择其中功能聚类显著和注释信息明确的热点区进行后续分析。
部分数据
传统的正向或者反向遗传学根据表型来找基因，而单独使用eQTL构建调控网络找基因更依赖基因注释，只能利用注释信息来推断关键基因。
eQTL常常被认为是连接基因和表型的桥梁，全面准确的基因注释信息将成为识别关键转录因子的有效工具。
综上所述，作者利用eQTL方法，结合转录组、基因组和表型数据，构建调控网络，通过分析热点区的基因，确定了关键调控因子，这种思路很值得学习。
方法部分
RNA测序和分析
- 利用illumina进行测序（hiseq2500）
- 获得150bp的双末端测序数据
软件与流程：
- 筛选：
Trimmomatic（版本0.33）筛选原始数据，去除adapters和low bases - 比对：
Tophat2将fastq文件比对到参考基因组 - 计数：
Stringtie统计每一千个碱基中片段数（FPKM）和reads的个数
筛选转录组和基因组SNPs
利用筛选过滤之后的转录组数据进行后续分析：
- 比对：
STAR将转录组数据比对到参考基因组 - 鉴定：
Sentieon Toolkit鉴定原始SNPs - 过滤：
VCFtools (v0.1.13)（参数如下）过滤原始SNPs，得到高质量SNPs
--minDP 4 --minQ 30 --max-missing 0.1 --maf 0.05
- 提取：
PLINK提取SNPs，剔除<0.05的SNPs
群体遗传分析
-
RAxML：基于转录组数据构建最大似然树 -
iTOL：绘制进化树 -
EIGENSOFT：基于转录组的SNP数据进行PCA分析 -
ggplot2：绘制PCA分析结果图 -
ADMIXTURE：推断群体结构，通过逐渐增加k值，并在每个k值处计算较差验证误差，最终确定一个k值，该值处误差最小，即分为k个亚群时最优。
鉴定eQTL
作者在基因表达水平上，筛选FPKM不为零的基因，共从55801个基因中筛选到23325个基因，用于后续分析：
-
qqnorm（R中的一个函数）对基因的表达数据进行正态分位数转换 -
FAST-LMM根据所有材料的基因组SNPs信息，对每个基因进行GWAS分析 -
GEC计算SNPs的有效数目 -
eQTL block指至少含有三个显著SNP位点的区域 -
hot_scan识别远端eQTL热点区
富集分析
利用下面两个网站对获得的不同基因进行功能富集分析：
- GO富集：http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/index.php
- KEGG代谢通路：http://systemsbiology.cau.edu.cn/PlantGSEAv2/index.php
共表达分析
基因计数后，去除表达量为零的基因，然后对数据进行标准化处理，进行共表达分析
WGCNA是一款R包，用于对基因表达数据集中的基因进行共表达分析。
全基因组关联分析
-
FAST_LMM程序：通过LMM（linear mixed model线性混合模型）进行GWAS分析 -
GEC计算SNP的Me值
全转录组关联分析
去除中位表达量（median expression）等于0的基因，剩下的用于TWAS分析：
-
EMMAX软件利用LMM模型进行关联分析 - 根据基因组SNPs计算IBS亲缘关系矩阵
论文数据文件：
NCBI_SRA_PRJNA858547
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