10X单细胞空间联合分析揭示病毒性心肌炎的发病机制

好了，这一篇我们继续分享单细胞空间联合分析的文章，大业未完成，我们仍需要努力，参考文章在Spatiotemporal transcriptomics reveals pathogenesis of viral myocarditis,虽然是圣诞节，奈何单身狗，还是好好学习吧。

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ABSTRACT

儿童和年轻人猝死的很大一部分是由于病毒性心肌炎，一种心脏炎症性疾病。在这里，使用集成的单细胞和空间转录组学来研究与呼肠孤病毒诱导的新生小鼠心脏心肌炎相关的宿主病毒相互作用的时间、空间和细胞异质性。进一步分析了呼肠孤病毒感染的主要部位肠道，以确定病毒的细胞靶点和最终导致心肌炎的分子事件的时间顺序。数据深入了解先天免疫反应的细胞类型特异性，以及招募循环免疫细胞的发炎心脏细胞的转录状态，包括诱导细胞焦亡的细胞毒性 T 细胞。心肌区域和边界区空间受限基因表达的分析确定了免疫介导的细胞类型特异性损伤和应激反应。总体而言，观察到与病毒性心肌炎相关的复杂的细胞表型和细胞相互作用网络。

INTRODUCTION

病毒感染是心肌炎的最常见原因。由此产生的炎性心肌病可导致心律失常、扩张型心肌病和死亡。在人类中，病毒性心肌炎的研究具有挑战性，因为可用诊断测试的敏感性低、疾病的急性发作、疾病的局灶性以及复杂心脏组织中免疫-病毒相互作用的极端异质性。在小鼠中，哺乳动物正肠病毒提供了灵活的模型系统。口服接种后，1 型朗 (T1L) 呼肠孤病毒株最初感染胃肠道。几天之内，感染会扩散到身体的继发部位，包括心脏，导致多达 50% 的感染发生心肌炎。然而，即使在这种小鼠模型中，病毒性心肌炎的分子发病机制也很难研究，因为所涉及的心脏和免疫细胞类型的复杂网络以及疾病的细胞、空间和时间异质性。因此，既没有确定负责先天免疫反应的细胞类型，也没有确定体内感染的细胞类型。同样，心脏内受感染和未受感染的旁观者细胞的反应尚未得到表征。此外，适应性免疫反应的保护性与破坏性影响尚未量化。在患有严重联合免疫缺陷 (SCID) 的小鼠身上进行的实验表明，心肌损伤和心力衰竭不需要适应性免疫反应，但这些观察结果并不排除免疫细胞介导的损伤在免疫活性小鼠中很重要的可能性。需要根据受感染心脏组织内的时间和位置对所有细胞表型进行无偏见的表征，以解决这些知识空白。

在这里，使用集成的单细胞和空间分辨 RNA 测序 (RNA-seq) 来研究感染后多个时间点呼肠孤病毒感染的新生小鼠心脏心肌过程的细胞和空间异质性。还应用这些技术来研究肠道内呼肠孤病毒感染的先天反应。此外，对感染不引起心肌炎的呼肠孤病毒点突变体的小鼠心脏组织进行了时间序列单细胞 RNA-seq (scRNA-seq)。为了建立病毒嗜性，对非聚腺苷酸化病毒转录本进行了分子富集。测量可以深入了解先天免疫反应的细胞类型特异性、肠道和心脏中病毒的趋向性以及参与炎症细胞因子产生和循环免疫细胞募集的细胞类型的转录状态.对心肌区域和这些区域周围边界区的空间受限基因表达的分析确定了不同细胞类型（包括心肌细胞）的损伤和应激反应。总体而言，数据确定了呼肠孤病毒诱导的心肌炎期间空间受限的细胞相互作用和细胞类型特异性宿主反应。

RESULTS

Single-cell and spatial transcriptomics of reovirus T1L-infected neonatal mice hearts

为了阐明呼肠孤病毒诱导的心肌炎的发病机制，分析了从被呼肠孤病毒 T1L 株或模拟对照口服感染的新生小鼠收集的心脏组织。在感染后 (dpi) 4、7 和 10 天生成了来自受感染心脏和模拟对照的 31,684 个细胞的 scRNA-seq 数据，以及来自受感染心脏的四个组织切片的 8,243 个空间转录组和来自同一窝的 4 dpi 和 7 dpi 模拟对照。单细胞转录组代表 18 种不同的细胞类型，包括心肌细胞、心内膜细胞、心脏成纤维细胞、内皮细胞、壁细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK 细胞、树突细胞、T 细胞和 B 细胞。空间转录组数据的聚类揭示了 7 dpi 呼肠孤病毒感染心脏中心肌区域和心肌区域周围的边界区域的不同转录程序，这些区域对应于通过 H&E 染色确定的组织损伤区域。 scRNA-seq 和空间转录组学的结合能够在空间环境中解析和可视化细胞类型和基因表达。由于病毒在传播到包括心脏在内的其他身体部位之前首先感染胃肠道，因此还在回肠上进行了 scRNA-seq 和空间转录组学。在 1 dpi 和 4 dpi 从模拟和感染样本中获得了回肠的 7,695 个单细胞转录组和 8,027 个空间点转录组。

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• 注：Supplementary Figure 1: Single-cell and spatial transcriptomics of cardiac tissue from reovirus-infected neonatal mice. A) Number of unique genes detected per cell (left), number of unique transcripts per cell (center), and percentage of mitochondrial transcripts (right) in cardiac scRNA-seq datasets from three stages after infection. B) Number of unique genes detected per cell (left), number of unique transcripts per cell (center), and percentage of mitochondrial transcripts (right) in cardiac spatial transcriptomics datasets from two stages after infection. C) UMAP plot of 31,684 single-cell transcriptomes from mock-infected and reovirus-infected hearts at 4, 7, and 10 days post-infection (dpi), clustered by gene expression and colored by cardiac cell type. Dotted lines show the cardiac cell types being grouped as broad endothelial cells and fibroblast cells. D) scRNA-seq UMAP plots showing expression of endothelial, and mural cell-specific markers used to define the Cdh5+ Kcnj8+ mesenchymal endothelial cells. E) Top 3 differentially expressed genes for cell types in heart scRNA-seq data. F) Spatial cell type proportions for myocarditic heart at 7 dpi derived by integrating scRNA-seq and spatial transcriptomics data using the Stereoscope method from scvi-tools.

为了准确地识别回肠和心脏中未聚腺苷酸化的呼肠孤病毒转录本，对 scRNA-seq 文库中捕获的病毒片段进行了基于杂交的富集。在回肠中，总共捕获了 13,100 个独特的病毒转录本，病毒载量从 1 dpi 降低到 4 dpi。在 1 dpi 时，肠内分泌细胞的感染细胞比例最高，其次是肠上皮细胞和杯状细胞，所有这些细胞都存在于肠道上皮中。淋巴内皮细胞在 4 dpi 时被感染，这表明病毒通过淋巴引流到达血液，从而使病毒能够传播到身体的二级部位，包括心脏。从 T1L 感染的心脏中的 392 个细胞中捕获了 2,762 个独特的病毒转录本。病毒载量首先从 4 dpi 增加到 7 dpi，然后从 7 dpi 减少到 10 dpi，与对整个心脏进行的病毒滴度测定一致。心内膜细胞和内皮细胞是 4 dpi 时最常感染的细胞类型，这表明心室腔内壁的心内膜细胞和心脏脉管系统内的内皮细胞是心脏中最先被感染的细胞之一。在 7 dpi 心脏中检测到中性粒细胞、树突细胞和 T 细胞中的病毒转录物。这一观察结果表明，抗原呈递细胞和免疫细胞可能有助于感染扩散到身体的其他器官。之前已经讨论了受感染的树突状细胞在全身感染期间将更多呼肠孤病毒带到心脏组织中的作用。

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• 注：Supplementary Figure 2: Single-cell and spatial transcriptomics of ileum tissue from reovirus-infected neonatal mice. A) Number of unique genes detected per cell (left), number of unique transcripts per cell (center), and percentage of mitochondrial transcripts (right) in ileum scRNA-seq datasets (top row) and ileum spatial transcriptomics datasets (bottom row) from two stages after infection. B) Top 3 differentially expressed genes for cell types in ileum scRNA-seq data. C) Spatial transcriptomes of ileum tissue sections from mock-infected and reovirus-infected mice at 1 and 4 dpi. D) Knee plot showing host gene specific UMI counts (left) and viral UMI counts in the scRNA-seq droplets classified as either empty droplets or with viable/dead cells across ileum scRNA-seq samples. E) scRNA-seq UMAP plots showing total viral UMI counts per cell before and after xGen-based viral transcript enrichment on ileum samples. F) Knee plot showing host UMI counts (left) and viral UMI counts in the scRNA-seq droplets classified as either empty droplets or with viable/dead cells across heart scRNA-seq samples. G) scRNA-seq UMAP plots showing total viral UMI counts per cell before and after xGen-based viral transcript enrichment on heart samples.

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Endothelial cells are primed with basal interferon response and play an important role in initiating host innate immune response

为了检测感染后心脏组织中的早期转录差异，进行了差异基因表达分析（DGEA，4 dpi 模拟与感染心脏，方法该分析揭示了感染心脏中 226 个基因的显著上调（双侧威尔科克森检验， log fold-change > 1.0 and p-value < 0.01)，包括与干扰素-β途径、干扰素信号传导和先天免疫反应相关的基因。

为了量化和比较不同细胞类型的早期感染反应的总体幅度，计算了一个基因模块评分（感染反应评分，IR，上面选择的 226 个基因的模块）。不同细胞类型在没有感染的情况下的 IR 比较显示，与其他心脏细胞类型相比，内皮细胞中的 IR 较小，但较高。作为对感染的反应，观察到所有心脏细胞类型的 IR 增加，但观察到内皮细胞的 IR 增加最大。这些数据表明，心脏脉管系统内衬的内皮细胞是宿主抵御病毒感染的重要发起者。使用空间转录组学数据比较 IR 分数显示，感染心脏在 4 dpi 和 7 dpi 中的 IR 分数增加，心肌区域的分数最高。鉴于观察到心脏内的内皮细胞在没有感染的情况下具有最高的 IR 评分，我们query这种观察是心脏组织独有的还是更普遍的现象。为此，使用了 Tabula Muris scRNA-seq 小鼠图谱并估计了 10 个不同器官的约 16,000 个细胞的 IR，包括五种主要细胞类型（上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和间充质细胞）和组织。该分析表明，内皮细胞在小鼠的所有组织中始终具有最高的 IR 评分。这些结果表明，血管内皮细胞在大多数组织内具有更高的先天反应基因的基础表达，这可能使这些细胞对血液和淋巴管内的病毒传播做出反应。

为了研究呼肠孤病毒感染的主要部位回肠中的细胞类型特异性 IR，与模拟感染的回肠细胞相比，在 1 dpi 时对呼肠孤病毒感染进行了 DGEA，发现 438 个基因显著上调（双侧 Wilcoxon测试，对数倍数变化 > 1.0 和 p 值 < 0.01)，与干扰素-β 通路、干扰素信号传导和先天免疫反应有关。使用这个由 438 个基因组成的模块计算了 IR 评分，并观察到与其他回肠细胞类型相比，肠细胞和肠内分泌细胞的基础 IR 评分更高。肠上皮细胞在感染后进一步表现出最高的 IR 评分增加，其次是肠内分泌细胞、内皮细胞和淋巴细胞。空间转录组数据的 IR 分数的比较进一步支持了对 scRNA-seq 数据的分析，显示感染回肠在 1 dpi 和 4 dpi 中的 IR 分数增加，其中肠黏膜和绒毛中的分数最高。肠上皮细胞必须耐受肠腔中存在的共生微生物，但仍对侵入性病原体有反应。数据分析表明，为了实现这一目标，肠道上皮细胞中的肠上皮细胞和肠内分泌细胞以基础干扰素反应为基础，并在病毒感染早期阶段的先天免疫反应中发挥重要作用。

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• 注：Supplementary Figure 3: Innate immune response across cell types in heart and ileum and transcriptional signatures for Cxcl9-high endothelial cells and cytotoxic T cells. A) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 2.0 and p-value < 10-4) for reovirus-infected cardiac cells as compared to mock at 4 dpi. Dotted lines show the thresholds for significantly enriched genes (red). B) Top GO terms for genes enriched in reovirus-infected cardiac cells as compared to mock at 4 dpi. C) Heatmap showing the expression of the 25 most upregulated genes in the reovirus-infected ileum as compared to mock at 1 dpi. D) Top GO terms for genes enriched in reovirus infected cells ileum as compared to mock-infected ileum at 1 dpi. E) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 2.0 and p-value < 10-4) upregulated in Cxcl9-high inflamed endothelial cells from heart at 7 dpi. Dotted lines show the thresholds for significantly enriched genes (red). F) Top GO terms of interest enriched for genes upregulated in Cxcl9-high endothelial cells in myocarditic heart at 7 dpi. G) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 2.0 and p-value < 10-4) upregulated in cytotoxic T cells at 7 and 10 dpi. Dotted lines show thresholds for significantly enriched genes (red). H) Top GO terms of interest enriched for genes upregulated in cytotoxic T cells in myocarditic hearts at 7 and 10 dpi. I-L) Spatial transcriptomics maps of cardiac tissue sections from reovirus-infected mice pups at 7 dpi showing I) The expression of genes enriched in Cxcl9-high inflamed endothelial cells. J) Gene module scores for four GO terms of interest enriched in Cxcl9-high inflamed endothelial cells. K) The expression of genes enriched in cytotoxic T cells from myocarditic heart. L) Gene module scores calculated for four GO terms of interest enriched in cytotoxic T cells from myocarditic heart.

Cytotoxic T cells recruited by inflamed endothelial cells induce pyroptosis

为了更详细地探索内皮细胞表型的异质性，在 scRNA-seq 数据中重新聚集了 9,786 个心脏内皮细胞。观察到四种不同的表型 i) 表达 Nr2f2 和 Aplnr 的未发炎的静脉内皮细胞主要来源于模拟对照，ii) 表达 Gja4、Gja5 和 Cxcl12 的动脉内皮细胞来源于模拟和感染的心脏，iii) 发炎的内皮细胞来源于感染4 dpi 和 10 dpi 时的心脏，以及 iv) 7 dpi 时来自心脏的发炎内皮细胞，b 发炎的内皮细胞簇表达 Isg15、Iigp1 和 Ly6a。 DGEA acro 内皮亚群显示，发炎的 7 dpi 内皮细胞过度表达趋化因子 Cxcl9 和 Cxcl10，它们通常参与免疫调节和炎症过程，但更具体地参与 T 细胞的募集。与这一观察结果一致，7 dpi 心脏中的 T 细胞表达 Cxcr3 受体。 Cxcl9 高发炎的内皮细胞还表达高水平的细胞粘附标记基因 Vcam1 和 Icam1，这有助于血液中的免疫细胞附着在内皮细胞上。内皮细胞还过表达 MHC 1 类（H2-D1 和 H2-K1）和 MHC 2 类（Cd74）分子，表明它们参与抗原呈递给适应性免疫细胞。内皮细胞已被证明参与抗原呈递和塑造感染性心肌炎中的细胞免疫反应。GO富集分析确定了进一步支持 Cxcl9 高内皮细胞参与白细胞细胞粘附、T 细胞活化、白细胞介素 8 产生的调节以及对细胞因子、肿瘤坏死因子、干扰素-γ、白细胞介素-1 的反应的途径。

观察到内皮细胞参与 T 细胞的募集，促使更详细地探索受感染心脏中 T 细胞的异质性。为此，重新聚集了 2,205 个 T 细胞单细胞转录组，产生了代表三种 T 细胞亚型的四个subclusters，i) Cd8+ 细胞毒性 T 细胞，ii) Cd4+ 辅助 T 细胞，和 iii) 幼稚 T 细胞。在受感染心脏内鉴定的细胞毒性和辅助 T 细胞均表达 Cxcr3 受体、干扰素-γ (Ifng) 和趋化因子 Ccl3、Ccl4、Ccl5、S100A4 和 S100A6，表明它们参与了中性粒细胞的募集和激活。 Cxcr3 受体选择性结合趋化因子 Cxcl9 和 Cxcl10，促进趋化性。细胞毒性 T 细胞代表大多数浸润性 T 细胞，并表达 Prf1、Gzma、Gzmb 和 Gzmk，编码与颗粒酶依赖性胞吐作用途径相关的裂解分子。这些细胞还表达肿瘤坏死因子超家族基因 Fasl 和 Tradd，它们参与 Fas 诱导的细胞死亡途径。 Fasl 与靶细胞表面的 Fas 结合并介导程序性细胞死亡信号传导和 NF-κB 激活。 Fasl-Fas 凋亡通路在调节 T 细胞、促进对自身抗原的耐受性方面很重要，并且是细胞毒性 T 细胞杀死靶细胞的一种机制。 GO 富集分析确定了涉及中性粒细胞活化和脱粒、外源肽抗原的加工和呈递、白细胞介素 1 介导的信号通路、肿瘤坏死因子介导的信号通路、NIK/NF-κB 信号通路、对凝集素的细胞反应和细胞凋亡过程的通路。

细胞死亡相关通路的下游基因标记 Pycard、Acer2、Zbp1 和 Caspases Casp1、Casp4 和 Casp12 在 Cxcl9 高内皮细胞中富集。这增加了细胞毒性淋巴细胞导致炎症内皮细胞死亡的可能性。内皮细胞的 GO 富集证实了细胞死亡途径的上调，包括参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性的激活、外源性凋亡信号通路的正调节和细胞焦亡途径。我们评估了空间转录组数据以验证 Cxcl9 高炎症内皮细胞和 T 细胞之间的直接相互作用，并且它们确实在心肌区域和边界 zo 中在空间上共定位。计算了与本体相关基因的基因模块评分，这些基因富含 Cxcl9 高内皮细胞和细胞毒性 T 细胞，用于空间转录组学数据，发现这些途径在心肌区域富集。总的来说，这些结果表明心脏血管内皮细胞充当血心屏障，并在宿主适应性免疫系统的募集和激活中发挥重要作用。这些细胞可能是呼肠孤病毒诱导的心肌炎期间直接病毒损伤和免疫介导损伤的目标。心脏内微脉管系统的损伤可能会导致血液供应减少，并成为随后与病毒直接复制无关的心肌细胞死亡的一个因素。

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Spatially restricted gene expression in myocarditic tissue

心肌炎的空间受限性质促使探索呼肠孤病毒感染心脏中基因表达的空间异质性。对空间转录组数据的初始聚类揭示了心肌区域、与这些心肌区域相邻的组织以及心室组织的其余部分的不同转录程序。这些区域的差异空间基因表达分析揭示了浸润免疫细胞的细胞类型标志物（T细胞的 Cd8a 和 Gzma，NK 细胞的 Nkg7，中性粒细胞的 S100a8）、炎症标志物（Cd52 和 Lyc62）的心肌区域的上调，以及趋化因子和细胞因子（Ccl5、Ccl2、Cxcl9 和 Cxcl10）。对相应 scRNA-seq 数据的分析表明，Ccl5 由树突细胞表达，Ccl2 由成纤维细胞表达，Cxcl9 和 Cxcl10 由内皮细胞表达。 Ccl2 的受体 Ccr2 在巨噬细胞中表达，表明成纤维细胞在心肌炎症期间使用 Ccl2-Ccr2 轴进行巨噬细胞募集，如最近所述。这些分析表明产生趋化因子的内皮细胞和产生细胞因子的成纤维细胞将免疫细胞募集到心肌组织。

对心肌区域和边界区的仔细检查显示其他感兴趣的基因上调，包括 Timp1、AW112010、Clu、Ankrd1、Gm4841 和 Ctss。 Timp1 在 scRNA-seq 数据中主要由发炎的成纤维细胞表达。 Timp1 是基质金属蛋白酶 (MMP) 的天然抑制剂，这是一组参与细胞外基质降解的肽酶。先前报道了在心力衰竭恶化的患者中 Timp1 的上调。 AW112010 在 scRNA-seq 数据中由发炎的内皮细胞和成纤维细胞表达，之前被发现编码干扰素诱导的小分泌蛋白，在对感染和炎症的先天免疫反应中起关键作用。在数据中，Clu 在来自所有心脏细胞类型的发炎细胞的一个子集中表达，并且先前显示在严重心肌炎期间上调。 Ctss 主要在单核细胞中表达，编码一种蛋白酶，用于将抗原蛋白降解为肽，以在 MHC II 类分子上呈递。已证明易感小鼠中免疫蛋白酶体的形成增加会影响病毒性心肌炎中抗原肽的产生和随后的 T 细胞活性。对边界区上调基因的 GO 分析揭示了与对肿瘤坏死因子的反应、对白细胞介素-1 的反应和 NIK/NF-κB 信号传导相关通路的富集。

为了进一步了解免疫细胞浸润对心肌区域周围细胞类型组成的影响，评估了细胞类型比例作为与组织中心肌区域距离的函数。 我们量化了心肌区域、边界区和心室组织其余部分的细胞类型比例，发现 Cxcl9 高内皮细胞、Ccl2+ 成纤维细胞、T 细胞、树突细胞和 NK 细胞的比例在 心肌区，心肌区心肌细胞比例减少。

为了了解在心肌区和边界区富集的 Ccl2+ 成纤维细胞的表型，从 scRNA-seq 数据集中重新聚集了 9,192 个成纤维细胞，并在 7 dpi 时从受感染的心脏中鉴定了一组不同的发炎 Ccl2+ 成纤维细胞。 这
287 个 Ccl2+ 成纤维细胞表达高水平的 MHC 1 类（H2-D1 和 H2-K1）、粘附标记基因 Vcam1 和 Icam1，以及其他基因，如 Serpina3g、C3 和 Ms4a4d。 此外，这些成纤维细胞还表达 Casp1 和 Casp4，表明响应细胞毒性 T 细胞的细胞pyroptosis activity。

为了研究炎症对心肌细胞中心肌细胞的影响，从 scRNA-seq 数据集中重新聚集了 502 个心肌细胞，并确定了三种不同的表型：i) 表达 Myl2、Myl3 和 Mb 的心室肌细胞来自模拟和感染的心脏在 4 和 10 dpi，ii) 表达标记物 Myl4、Myl7 和 Nppa 的心房肌细胞在 4 dpi 和 10 dpi 时源自模拟和受感染的心脏，以及 iii) 在 7 dpi 时来自感染心脏的发炎肌细胞表达先天免疫基因 Isg15、Igtp 和 Iigp1。与来自感染心脏的 4 dpi 和 10 dpi 的心肌细胞相比，7 dpi 感染心脏的发炎肌细胞具有不同的表型，后者与来自模拟 299 感染心脏的心肌细胞聚集在一起。为了找到存在于边界区的肌细胞的转录特征，我们选择了在 scRNA-seq 数据中富含心肌细胞并在边界区上调的基因。该分析显示边界区的心肌细胞表达 Gm4841、Gm12185、Mt1、Mt2、Ankrd1 和 Nppb。 Gm4841 和 Gm12185 是响应干扰素 304 γ 产生的干扰素诱导基因。 Mt1 和 Mt2 基因调节炎症并支持小鼠缺血性心肌病的重塑。 Ankrd1 是一种肌细胞存活因子，发生在特发性扩张型心肌病患者的晚期心脏病期间。最近的一项研究表明，在心肌梗塞后第 1 天，表达 Ankrd1 的心肌细胞位于边界区。总之，我们的分析表明，组织损伤定位于心肌区域，在边界区进行重塑程序活跃，并证明了空间分辨分子测量对研究病毒性心肌炎的重要性。

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• 注：Supplementary Figure 4: Cell-type-specific gene expression in myocarditic tissue and differences in viral tropism between reovirus wildtype (WT) and mutant (K287T) infection. A) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 0.5 and p-value < 10-2) upregulated in myocarditic regions in heart at 7 dpi as defined by unsupervised clustering on spatial transcriptomes. Dotted lines show the thresholds for significantly enriched genes (red). B) UMAP plot for heart scRNA-seq cells and spatial transcriptomic maps for reovirus-infected heart at 7 dpi showing the expression of Ccl2 ligand and Ccr2 receptor. C) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 0.5 and p-value < 10-2) upregulated in the border zone of the infected heart at 7 dpi, as defined by unsupervised clustering on spatial transcriptomes. Dotted lines represent thresholds for significantly enriched genes (red). D) scRNA-seq UMAP plots showing the expression of six genes of interest enriched in myocarditic regions and the border zone. E) Top GO terms of interest for genes upregulated in Cxcl9-high endothelial cells in myocarditic heart at 7 dpi. F) Spatial transcriptomic maps for myocarditic heart at 7 dpi showing the expression of six myocyte-specific genes upregulated in the border zone. G) UMAP plot of 9,192 fibroblast cell transcriptomes from mock-infected and reovirus-infected hearts at 4, 7, and 10 dpi colored by fibroblast cell subtypes (phenotypes) (top) and condition (bottom). H) Heatmap showing top-five differentially expressed genes (Wilcoxon test, log2 fold-change > 1.0 and p-value < 0.01) for fibroblast cell subtypes. I) UMAP plot showing the expression of genes upregulated in Ccl2+ fibroblast cells. J) UMAP plots showing the gaussian kernel density of scRNA-seq cells across mock-infected, reovirus-WT infected, and reovirus-K287T infected hearts. K) Bar plot showing mean viral transcript count (UMIs) across stages for mock-infected, reovirus-WT infected, and reovirus-K287T infected hearts. L) Dot plot showing the percentage of cells with non-zero viral transcripts and the mean viral transcript counts (UMIs) across cell types.

Reduced adaptive immune cell infiltration associated with reovirus K287T mutant

最近报道了一种呼肠孤病毒突变体 T1L S4-K287T (K287T)，它对编码外衣壳蛋白 sigma-3 (σ3) 的 S4 基因进行了点突变，这是一种双链 (ds) RNA 结合多功能蛋白，可促进病毒蛋白合成和促进病毒进入
部件。 K287T 成功感染心脏，但产生的病毒滴度相对于呼肠孤病毒野生型 (WT) 而言较低，并且不会引起心肌炎。为了验证发现，在 4、7 和 10 dpi 时对 K287T 感染的心脏进行了额外的 scRNA-seq。总共生成了 16,771 个单细胞转录组，并将这些数据与来自 w 型 (WT) 病毒的数据进行了整合。对于几乎所有细胞类型，K287T 感染的细胞与 WT 感染的细胞聚集在一起。进行了病毒转录本富集，并比较了 WT 和突变体感染细胞中的病毒转录本。在 4 dpi 时发现病毒转录本 WT 和 K287T 病毒的水平相似，但在 7 dpi 时 K287T 的病毒载量降低了 60 倍，与病毒滴度测定一致。然后比较了由于 K287T 和 WT 感染引起的卡片细胞类型之间的早期宿主反应。 K287T 诱导了与 WT 呼肠孤病毒相似水平的先天免疫反应，内皮细胞在 4 dpi 时心脏评分的增幅最高。分析了 K287T 和 WT 感染的心脏之间 Cxc 高内皮细胞和免疫细胞的细胞类型组成，发现 7 dpi K287T 感染的心脏在 7 dpi 中浸润心脏的 Cxcl9 高内皮细胞和免疫细胞显著减少WT 感染的心脏。这些差异与与 K287T 突变体相关的炎症和组织损伤水平降低一致。结果表明，即使感染了 K287T 突变病毒，大多数类型的复制减少，心脏内皮细胞也会产生强大而强大的先天免疫反应。病毒从感染细胞中清除 7 dpi 和较弱的适应性宿主反应然后导致突变 K287T 感染心脏的非心肌表型。

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DISCUSSION

50 多年来，病毒性心肌炎一直被认为是导致心力衰竭的原因，但它仍然是一种研究、诊断和治疗的具有挑战性的疾病。在这里，使用集成的 spa 和单细胞 RNA-seq 来剖析新生小鼠模型中 reovir 诱导的急性心肌炎的时间、空间和细胞异质性。在感染后的多个时间点检测了回肠和心脏组织。我们研究了被感染的细胞类型，以及先天性和适应性免疫反应的细胞和空间异质性。生成总共十三个 scRNA-seq 和八个空间转录组数据集，跨越两个有机体四个时间点和三个感染条件。我们的数据提供了对导致呼肠孤病毒诱导的心肌炎的分子事件的年表的详细见解。口服接种后，呼肠孤病毒 T1L 在 1 dpi 内感染肠道上皮中的肠内分泌和肠上皮细胞。这些细胞会产生有效的先天免疫反应来抑制病毒复制。然后病毒会在 4 dpi 内感染肠道淋巴细胞，并通过淋巴引流，病毒通过血流传播到身体的次要部位，包括心脏。大约 4 dpi，病毒会感染心脏血管系统的内皮细胞。内皮细胞在心脏中产生强大的先天免疫反应。在有症状的情况下，发炎的内皮细胞会分泌趋化因子来招募循环免疫细胞，包括细胞毒性 T 细胞。组织浸润的细胞毒性 T 细胞然后在心肌组织中诱导细胞焦亡。总体而言，实验揭示了与呼肠孤病毒诱导的心肌炎相关的细胞表型和细胞间相互作用的动态和空间异质网络。

集成的高通量 scRNA-seq 和空间转录组学最近被用于研究心脏发育和心脏病，但在工作之前，这些方法尚未用于研究病毒性心肌炎。 Bulk RNA-seq 先前已被用于分析与病毒性心肌炎相关的感染、炎症和组织损伤的转录组学特征。然而，这些整体水平的方法并没有捕捉到宿主对感染反应的细胞和空间异质性。 scRNA-seq 最近已用于研究小鼠模型中柯萨奇病毒 B3 (CVB3) 诱导的心肌炎。拉斯拉多等人。报告骨髓细胞的炎症表型、成纤维细胞在重塑和炎症中的作用，以及细胞毒性 T 细胞在 CVB3 诱导的心肌炎中的作用。然而，本研究未探讨病毒靶向的心肌细胞类型、基础干扰素反应和先天免疫反应的细胞类型异质性以及转录程序的空间限制。

以前的研究声称病毒复制对心脏细胞的直接细胞病变作用是呼肠孤病毒诱导的心肌炎期间心脏损伤的主要原因。值得注意的是，发现呼肠孤病毒感染可在缺乏 B 和/或 T 细胞的免疫缺陷小鼠中诱发心肌炎，表明呼肠孤病毒诱导的心肌炎并不严格需要适应性免疫。然而，这些先前的实验并不排除宿主适应性免疫反应可以增强或限制免疫能力小鼠中宿主损伤的性质和数量的可能性，正如我们的工作所建议的那样。研究了先天免疫反应在呼肠孤病毒诱导的心肌炎中的保护作用。然而，在我们的工作之前，基础 I 型 IFN 和先天免疫反应的时间、空间和细胞类型异质性尚未得到表征。宫本等人。和斯图尔特等人。在体外比较了心肌细胞和成纤维细胞之间 I 型 IFN 的基础水平，但这些研究并未包括构成复杂心脏组织的所有细胞类型。

病毒性心肌炎的时空特征对于了解对疾病病理学很重要的病毒和宿主因素至关重要。 这些知识最终可能会导致新的诊断方法和更好的治疗方法。 几种经常感染人类的病毒可引起心肌炎，包括腺病毒、肠道病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类疱疹病毒 6、细小病毒 B19 和 SARS-CoV2。 我们在这里实施的方法可用于未来的研究，以研究这些病毒诱导的心肌炎的诱导、病理生理学和病程有何不同。 希望我们在这里提供的数据和分析程序将成为此类未来研究的宝贵资源。

Method

Single-cell RNAseq data processing and visualization

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Spatial transcriptomics data processing, integration, analysis, and visualization

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生活很好，有你更好