影响因子：5.7
研究概述：非特异性眼眶炎症(NSOI)是一种良性、非感染性疾病，影响中年人，尤其是女性。其占所有眼部疾病的6%~16%，占眼眶恶性肿瘤的11%。目前，NSOI的病理生理学根源尚不清楚。虽然全身性皮质类固醇被用作NSOI的一线干预措施，但长期使用会伴随不良反应并且其复发率超过50%，迫切需要了解其分子特征以开发减少复发和改善患者预后的创新治疗方式。嘌呤对生命至关重要，其为DNA和RNA合成提供底物，并在能量产生和脂肪酸生物合成等细胞功能中发挥重要作用。它们还参与免疫反应并促进宿主和病原体之间的相互作用。由于癌细胞代谢快、对嘌呤需求大，而嘌呤抗代谢物可抑制DNA合成以及减少细胞生长。因此，通过使用嘌呤抗代谢物靶向嘌呤代谢途径是治疗癌症或非肿瘤疾病包括的潜在有效策略。尽管将嘌呤代谢与免疫治疗相结合是治疗NSOI的一个很有前景的途径，但在免疫原性和免疫治疗干预的背景下，嘌呤代谢在免疫治疗中的作用仍未被探索。本研究旨在评价嘌呤代谢基因(PMGs)在NSOI免疫治疗中的作用，寻求新的治疗靶点从而改善NSOI的治疗。
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研究流程如下：
研究结果：
差异表达基因(DEG)的鉴定及主成分分析(PCA)
作者首先确定了92个已知的嘌呤代谢基因(PMGs)。通过主成分分析发现，一些PMGs在治疗组和对照组中的表达存在显著差异。如治疗组中的NME7、POLR2L、POLD2、POLR3D、POLD4、PDE6B、GUCY2C等，对照组中的ENTPD5、GUCY1A3、GUCY1B3、RRM2B、PFAS、PDE6D等(图2A)。随后作者对这些表达存在显著差异的PMGs进行了相关性分析，结果如图2B所示。
PMGs的富集分析
作者通过对PMGs的GO富集分析，发现共有436核心途径，包括生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)。其中分子功能主要涉及鸟嘌呤核苷酸结合(GO:0019001)和鸟苷核糖核苷酸结合(GO:0032561)；细胞组分主要涉及细胞投射膜(GO:0031253)和囊泡腔(GO:0031983)；细胞过程主要涉及中性粒细胞激活(GO:0042119)和中性粒细胞介导的免疫(GO:0002446)。而KEGG通路富集分析显示过表达的PMGs基因主要参与亨廷顿病(hsa05016)、嘌呤代谢(hsa00230)和血管平滑肌收缩(hsa04270) (图3)。
模型构建
接着作者采用了一种方法学上的三联分析法以描述具有显著预测效用的基因特征，包括LASSO回归分析、Cox比例风险回归分析和最佳截断值的识别，如图4A、B所示。作者通过SVM-RFE构建机器学习模型，并对该模型的预测准确性和可靠性进行了验证。结果显示，该模型的准确率为0.883，错误率为0.117(图4C, D)。而通过LASSO和SVM方法确定了7个重叠的hub基因 (图4E)。随后，对7个hub基因分析发现它们的AUC值显著较高，表明它们具有较强的预测能力：ENTPD1 (AUC=0.800)、POLR2K (AUC=0.903)、NPR2 (AUC=0.851)、PDE6D (AUC=0.677)、PDE6H (AUC=0.627)、PDE4B (AUC=0.712)和ALLC (AUC=0.690)(图4F)。值得注意的是，该模型在GSE58331数据集中实现了1.000的AUC(95%置信区间:1.000-1.000)，表明其具有卓越的精度和稳定性(图4G)。
在解决有关AUC值的问题时，必须强调观察到的AUC为0.883，如图4所示。这一指标明确证明了该预测模型具有很高的准确性。虽然个体遗传变异可能导致AUC值的波动，但至关重要的是要强调所评估基因的累积AUC值始终接近或超过0.7的显著阈值。这一结果的综合大大增强了该预测框架的有效性、精确性和弹性，肯定了其在临床和研究环境中的潜在效用(表1)。
GSEA分析
作者通过评估文献和模型中hub基因的灵敏性，发现PDE4B和PDE6H可能是与NSOI最相关的基因。GO分析显示，PDE4B主要参与抗原接受或介导的信号通路、染色质重塑、免疫应答激活等生物过程。PDE6H主要涉及基于免疫受体体细胞重组的适应性免疫反应、α-β T细胞活化和gobp适应性免疫反应等生物过程(图5A)。KEGG通路分析结果表明，PDE4B主要与蛋白质输出、RNA降解和泛素介导的蛋白质水解有关，而PDE6H主要参与T细胞受体信号通路、泛素介导的蛋白水解和RNA降解(图5B)。
免疫细胞分析
免疫微环境在NSOI的发生和发展中起关键作用。作者随后对免疫细胞的表达进行了评估。图6A结果显示，治疗组高表达初始B细胞、记忆性B细胞、滤泡辅助性T细胞、静息性NK细胞、M0型巨噬细胞和活化的肥大细胞，而对照组的记忆细胞、活化的NK细胞、M2型巨噬细胞和休眠的肥大细胞占比明显较高。此外，作者对上述7个hub基因与免疫细胞的相关性进行了分析，结果显示PDE4B与初始B细胞和M1型巨噬细胞呈正相关，与记忆性B细胞、激活的DC细胞、M2型巨噬细胞、单核细胞和调节性T细胞呈负相关；PDE6H与记忆性B细胞、活化的肥大细胞、调节性T细胞呈正相关，与初始B细胞和活化的记忆CD4 T细胞呈负相关(图6B)。同时，作者还分析了PDE4B和PDE6H的免疫浸润情况(图6C, D)。
GSVA分析
GO分析发现，PDE4B主要参与黄酮代谢过程和类黄酮糖醛酸化生物过程以及肌钙蛋白复合物细胞组分。PDE6H主要涉及的生物过程为T细胞受体基因的体细胞多样化和细胞对成纤维细胞生长因子趋化的负调控，参与的细胞组分为巴氏小体和管状内体，涉及的分子功能为脂质抗原结合(图7A)。KEGG富集分析发现，PDE4B主要涉及神经活性配体-受体相互作用、嗅觉转导、肾素-血管紧张素系统；而PDE6H主要参与非同源末端连接、B和T细胞受体信号通路(图7B)
药物-基因相互作用
作者通过对7个hub基因进行分析，获得了共17预测的药物。这些药物包括奈西立肽、双嘧达莫、己酮可可碱、氨茶碱和罗氟司特等。图8结果展示了通过Cytoscape3.7.1可视化的药物-基因相互作用。
常见RNA的鉴定及miRNA-lncRNAs共享基因网络的构建
作者在三个数据库中检索了242个与NSOI相关的miRNA和284个与NSOI相关的lncRNA(补充表S7A, B)。补充表S7显示了这些基因与相应miRNA数据库的匹配。这些数据库包括miRanda、miRDB和TargetScan。当相应的数据库与相关的miRNA匹配时，得分为1。可以看出，当三个数据库都能匹配时，得分为3分。将miRNA通过spongeScan进行匹配，得到相应的lncRNA数据。取miRNAs-lncRNAs-基因与共享基因的交集(通过Lasso回归、随机森林法和SVM-RFE得到)构建miRNAs-lncRNAs-基因网络。最终，作者得到的miRNA-基因网络包括207个lncRNA、216miRNA和6个hub基因，包括ENTPD1、PDE4B、PDE6H、PDE6D、POLR2K和NPR2(图9)。
Hub基因验证
作者通过使用GSE105149数据集对上述7个hub基因进行验证，以提高模型对这些hub基因的置信度和预测精度。然而，在这7个PMGs中，只有NPR2在GSE105149表现出显著差异(图10)。作者重新分析发现，该结果出现可能是两个数据集的样本量和患者的来源不同导致的。
模型验证
作者对该模型进行了进一步验证，图11A箱线图描绘了这些hub基因在NSOI中的残留表达模式。有趣的是，四种不同模式的比例存在一些差异(图11B)。而GlnMgs在区分NSOI和对照样品方面的诊断能力显示出良好的诊断价值，RF的AUC为0.994；SVM为0.994；XGB为0.983；GLM为0.966(图11C)。图11D结果显示，GSE105149的AUC为1.000 (95%可信区间为1.000-1.000）。
孟德尔随机化分析
作者使用森林图来直观地表达PDE4B，PDE6H和NSOI之间的内在联系。对于PDE4B，SNP rs3132451明显位于置信区间的右侧，表明呈正相关。相反，在左侧观察到rs1611236和rs9378193增强了该研究结果的可信度(图12A)。在PDE6H的情况下，snp rs9378193、rs1611236和rs3132451都位于置信区间的右侧(图12B)，表明与NSOI有类似的关联趋势。对分析中固有的异质性进一步剖析发现，尽管保持了一般对称性，但偏离了预期的对称分布。这一微妙的观察结果通过敏感度分析（使用“留一个”的方法）得到了进一步的检验。值得注意的是，分析中遗漏的任何单个SNP对逆方差加权(IVW)分析结果的影响可以忽略不计，这表明剩余的SNP始终反映了总体数据集的结果。为了证实该发现的有效性，作者引用了egger回归分析，该egger分析为结果和应用的方法的稳健性和真实性提供了坚实的基础。最后，孟德尔随机分析亦证实PDE4B和PDE6H与NSOI密切相关。以上结果表明，通过干预PDE4B和PDE6H的功能是调节NSOI的发生、演变和进展的潜在策略。
研究总结：
NSOI是一种罕见的眼部异常疾病，表现为严重的眼眶水肿。NSOI的发病机制和进展是复杂的多因素相互作用的结果，目前其分子机制尚不清楚，但一般认为受基因表达调控的影响。由于嘌呤参与细胞代谢和信号传导过程，并与肿瘤细胞增殖和治疗抵抗密切相关。而嘌呤代谢紊乱可导致基因和蛋白表达的改变，从而增强细胞的恶性程度和转移。因此，了解疾病进展过程中嘌呤代谢的复杂模式有助于开发NSOI管理和治疗的靶向治疗策略。本研究发现了92个与NSOI的嘌呤代谢相关的DEGs，并确定了7个对NSOI具有显著诊断潜力的关键PMGs (ENTPD1、POLR2K、NPR2、PDE6D、PDE6H、PDE4B和ALLC)。作者深入分析后发现PDE4B和PDE6H是影响NSOI的病理生理的关键基因，可能是NSOI的潜在治疗靶点。
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