影响因子：12.4
研究概述：细胞焦亡在免疫反应中起着至关重要的作用。然而，细胞焦亡对胃癌 （GC） 肿瘤微环境（TME）重塑和免疫治疗的影响尚不清楚。在这个研究中，作者通过大样本GEO队列深入探索细胞焦亡的免疫调节作用。通过TCGA队列分析与细胞焦亡相关的多个生物学过程，构建了细胞焦亡风险评分（PRS）模型。并验证了PRS的预后性能以及与免疫细胞浸润水平的相关性。研究表明，细胞焦亡激活肿瘤微环境中的免疫过程。低 PRS患者与肿瘤部位抗肿瘤免疫细胞浸润增强、焦亡活性增加和患者预后改善相关。构建的PRS可作为细胞焦亡分析的有效定量工具，为GC患者提供更有效的免疫治疗策略。研究的总体设计如图1所示。
研究结果：
细胞焦亡在GC肿瘤微环境中起免疫调节作用
作者利用GeneCards数据库检索GC免疫抑制相关的基因，并分析在TCGA队列以及临床样本中差异表达的基因。作者发现，AIM2、CASP1、CASP3、CASP4、CASP5、CASP6、CASP8、DHX9、DPP8、GSDMB、GSDMD、DFNA5、GZMA、GZMB、HMGB1、IL18、IL1B、NAIP、 NLRP1、NLRP3、PYCARD、STAT3、TREM2、ZBP1这24个基因可以作为GC细胞焦亡的关键基因。根据无监督聚类分析鉴定GC的焦亡表型，并根据这24个基因在不同的聚类模块中聚集的数目分为高焦亡簇，中焦亡簇，低焦亡簇（如图2A-B）。将这三个聚类模块进行生存分析发现，高焦亡簇患者预后良好，低焦亡簇患者预后最差（如图2C-D）。
作者通过TIDE、IPS、ESTIMATE等算法评估不同聚类与免疫细胞浸润水平之间的相关性（如图3A）。结果显示，高焦亡簇中具有抗肿瘤活性的免疫细胞（如T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞）的浸润水平更高，与免疫促进作用相关（如图3B）。相比之下，低焦亡簇与免疫抑制作用相关。通过多种富集分析发现，高焦亡簇主要聚集于抗肿瘤免疫反应等通路。上述分析证明细胞焦亡在GC的TME中起着关键的免疫调节作用。
细胞焦亡的多组学与免疫环境分析
为了计算每个患者的焦亡程度，作者基于24个与焦亡相关基因的mRNA表达水平，使用PCA构建了 PyScore 的评分系统，将GC焦亡水平进行量化。根据 PyScore中位数，将患者分为高焦亡组和低焦亡组。随着PyScore的增加，焦亡相关基因的表达量也增加（如图3C）。作者确定了最有可能参与调节细胞焦亡的分子事件，包括差异表达的长链非编码RNA、蛋白编码RNA、miRNA、CpG位点甲基化以及甲基化区域中的基因（如图3C）。接下来，作者验证了细胞焦亡在肿瘤微环境中的免疫调节作用。通过从TCGA-STAD队列中获取HE染色数据，评估高、低焦亡组患者的胃癌组织病理结构（如图3D）。结果显示，高焦亡组的胃癌组织切片呈现出三级淋巴结构。而在低焦亡组的胃部切面中没有观察到这种变化（如图3D）。并且，肿瘤浸润淋巴细胞的数量在高焦亡组的胃癌组织切片中显著增加（如图3E）。
细胞焦亡程度与多种免疫细胞的浸润水平呈正相关，并与GC中各种免疫检查点的表达呈显著正相关（如图4A-B）。多项富集分析显示，焦亡富集于多条与免疫调节相关的通路，如MHC抗原呈递反应、细胞毒性、TCR信号传导和细胞死亡（如图4C-E）。这些发现表明，焦亡与免疫细胞浸润之间呈显著正相关。作者的研究结果有力地证实了细胞焦亡在TME中的免疫调节作用。
基于细胞焦亡表型构建焦亡风险评分
鉴于细胞焦亡是由多种分子事件共同介导的，作者利用GC预后的免疫细胞焦亡关键基因构建了一个能够有效快速评估GC诊断与治疗的模型。将在高、低焦亡组之间的差异表达基因引入LASSO-Cox回归模型中，生成预测模型。最终，获得最佳模型PRS，包括与预后显著相关的四个基因（PTPRJ、BATF2、RGS1和VCAN）（如图3F、5A-B）。所有四个与风险相关的基因在细胞焦亡中发挥关键作用（如图3G-H）。高焦亡组的患者部分归类为低PRS组，而低焦亡组的患者部分归类为高PRS组（如图5C）。PRS对TCGA队列中GC患者预后的预测能力准确可靠（如图4D）。PRS与胃癌患者的预后成正相关（如图5E-F）。PCA结果显示，PRS可以区分整个胃癌患者人群（如图5G）。图4H展示了PTPRJ、BATF2、RGS1和VCAN表达水平与PRS之间的相关性。作者还通过六个易获得的临床特征开发了诺莫图作为预测模型，以指导胃癌患者个体化治疗（如图5I）。接下来，作者全面探讨了PRS在GC患者中的临床意义和免疫环境。
验证PRS的预后效能和临床特征
为进一步验证PRS在GC中的预后价值，作者利用五个医学队列的术后标本进行免疫组化（IHC）来检验PRS的预后潜力（如图6）。ROC曲线表明，PRS预测五个队列中的预后能力可靠准确（见图6A）。PRS的预测准确性明显优于AJCC 8th、年龄和性别等因素（如图6A）。生存分析显示，在所有五个队列中，低PRS组具有显著的生存优势（如图6B）。多个队列中的单因素和多因素Cox回归分析验证了PRS的预后价值（如图6C）。总而言之，多数据分析显示，PRS可以在不受其他临床因素的干扰下作为GC患者的预后标志物。
PRS的细胞焦亡和免疫环境
为进一步构建PRS的免疫环境，作者利用ssGSEA算法对中心患者的免疫细胞丰度进行聚类。将这些患者分为三组，即高、中和低免疫组（如图7A）。作者利用IHC来评估肿瘤中心（CT）和浸润边缘（IM）的CD8+免疫细胞的表达，以验证三组中免疫细胞的浸润情况。高免疫组展现出病理上的“免疫炎症”表型，而中免疫组显示出“免疫排斥”的病理特征，而低免疫组呈现“无免疫”表型（如图7B-C）。上述结果显示，在三种免疫亚型中PRS有显著变化，“免疫排斥”亚型得分升高，而“免疫炎症”亚型得分降低（如图6D，7A）。
在低PRS组中，免疫炎症型肿瘤的比例明显高于高PRS组（如图8B）。另外，作者发现PRS可能与T细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的空间分布和功能相关。所以作者对包括四个PRS最高和四个PRS最低的样本进行了单细胞RNA测序分析。通过无监督的细胞聚类分析，共获得了14个独特的细胞簇（内皮细胞、上皮细胞、效应T细胞、CD4+ T细胞、浆细胞、内分泌细胞、增殖细胞、成纤维细胞、肥大细胞、B细胞、树突状细胞、外周细胞、单核细胞和巨噬细胞（如图8C）。并且量化了这八个样本中各种细胞簇的含量（如图8D）。效应T细胞和CD4+ T细胞含量在高PRS组、低PRS组之间有显著差异（如图8E）。作者使用CD8和GZMB来表征效应T细胞，用CD4来表征CD4+ T细胞。并通过多重免疫荧光染色研究PRS对这些细胞的浸润和空间分布的影响。结果表明，效应T细胞和CD4+ T细胞在PRS低组的肿瘤巢和基质中富集（如图8F-G）。
作者进一步探究了不同PRS人群中TAM浸润极化的特征。结果显示，低PRS组的M1型巨噬细胞富集程度更高，而高PRS组的M2型巨噬细胞富集程度更高（如图8H）。这表明在高PRS人群中，M2型巨噬细胞的极化占主导地位并在肿瘤中心积聚。免疫环境分析显示，低PRS组与抗肿瘤免疫细胞浸润水平增加相关，这在胃癌的诊断和治疗中通常被视为一种积极信号。因此，有必要评估在低PRS患者中实施免疫治疗的益处。
PRS预测GC患者在新辅助免疫治疗中的益处
在新辅助免疫治疗前，作者收集了48例GC患者的胃镜组织切片。多重免疫荧光染色图像显示，PRS可以有效评估胃镜组织（如图9A）。患者在免疫治疗后通过影像学评估肿瘤缩小等级（TRG）和RECIST标准（如图9B-C）。作者发现，在低PRS组中出现更大范围的肿瘤缩小，并且PRS在肿瘤缩小组（TRG1a/1b）中显著降低（如图9D）。此外，作者通过影像学RECIST评估发现，低PRS患者的客观反应率（ORR）更高。在低PRS的患者中，三名患者表现为完全缓解（CR），13名患者表现为部分缓解（PR），客观反应率为66.7%，显著高于高PRS患者（ORR = 33.3%）（如图9E）。与对照组相比，在CR/PR组中的PRS明显更低（如图9E）。ROC诊断曲线显示，PRS的AUC显著优于CPS和免疫性炎症表型（如图9F-G）。单变量和多变量 logistic 回归分析结果显示，PRS与免疫治疗受益之间呈强相关（如图9H-I）。此外，低PRS患者的术后无复发生存率显著优于高PRS患者（如图9J）。这些结果表明PRS可以用于评估从新辅助免疫治疗中获益显著的胃癌患者。
接受免疫治疗的患者同时接受了新辅助化疗。因此，将仅接受相同新辅助化疗方案的49名患者纳入对照组。接受新辅助化疗患者的ROC诊断曲线显示，PRS的AUC值分别为0.658（用于TRG评估）和0.661（用于ORR评估），低于接受新辅助免疫治疗患者的AUC值（TRG评估AUC=0.787；ORR评估AUC=0.780）（如图9F-G）。总体而言，这一发现表明PRS的预测能力可能更具体地针对新辅助免疫治疗。
这项研究旨在确定接受新辅助化疗的患者群体中哪些人将从免疫治疗中获益显著。通过比较两组之间免疫治疗的效果，作者发现接受新辅助免疗治疗的低PRS组患者与仅接受新辅助化疗的患者相比获益增加（如图9K）。然而，在高PRS组中未观察到这种现象。随后，作者根据患者的PRS和CPS分数对所有接受新辅助治疗患者进行分层。结果表明，在仅接受新辅助化疗的患者中，在具有低PRS和CPS≥1的患者中免疫治疗有显著的益处（如图9L）。而其他组的分层比较分析结果显示，这些接受或不接受新辅助免疗治疗的患者无显著变化。综上所述， PRS 是评估 GC 患者免疫治疗获益的强大模型，可以有效识别需要新辅助免疫治疗的 CPS≥1 患者。
研究总结：
在这项研究中，作者利用多种公共数据库来揭示细胞焦亡在肿瘤免疫微环境中的关键作用，并对影响GC细胞焦亡调节的多种分子事件进行了研究。作者基于焦亡的关键调节分子开发了可应用于病理组织的焦亡风险评分PRS模型。最终发现，细胞焦亡可以激活TME中的免疫过程。低 PRS患者与肿瘤部位抗肿瘤免疫细胞浸润增强、焦亡活性增加和患者预后改善相关（如图10）。并且，这项研究中构建的PRS模型可作为细胞焦亡分析的有效定量工具，适用于病理组织识别，可以作为GC患者接受更有效的免疫治疗的指导策略。
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