影响因子：5.8
研究概述：
内质网膜蛋白复合物亚基6（EMC6），也称为跨膜蛋白93 (TMEM93)，在细胞的生理和病理状态中都起着重要作用。本研究全面分析了EMC6在33种癌症中的功能机制，进行了一系列的生物信息学分析，包括差异表达分析、肿瘤突变负荷分析、预后分析和临床病理分期分析。然后通过细胞学和体内实验验证了EMC6在肺癌中的作用：EMC6调节肺腺癌中免疫细胞的浸润以及调节肺腺癌中铁死亡和铜死亡的发生。
流程图：
研究结果：
一、EMC6在多种癌症中的高表达与患者预后密切相关
1. 基于TIMER数据库中33种癌症中EMC6的表达，作者发现，除肾嗜色细胞癌（KICH）和肾透明细胞癌（KIRC）中的表达水平显著降低外，EMC6在大多数癌症中的表达极高于相应的正常组织（图1A），在膀胱尿路上皮癌 （BLCA）、乳腺浸润癌（BRCA）、食管癌 （ESCA） 和 肺腺癌（LUAD）中尤为明显。
2. TMB值显示了肿瘤细胞中基因突变的情况，这些具有更多基因突变的肿瘤细胞更能够刺激免疫反应。因此TMB值也能在一定程度上反映患者的预后。
33种癌症的TMB分析结果显示，EMC6的表达与胃腺癌（STAD）、肉瘤（SARC）、子宫体子宫内膜癌（UCEC）和LUAD的基因突变密切相关（图1B）。
3. 基因表达变异对患者预后的影响是衡量该基因是否为此类癌症重要生物标志物的关键标准。
单因素Cox回归分析森林图显示，EMC6表达改变对宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌（CESC）、ESCA、脑低级别胶质瘤（LGG）等7种癌症的患者预后有显著影响（图1C）。其中，EMC6的表达对LUAD患者的预后影响最为显著（p < 0.001）。
4. 在总生存期 OS分析中，与肾上腺皮质癌 ACC、CESC、LGG、LUAD、肺鳞癌 LUSC和胰腺癌PAAD相比，EMC6高表达患者与EMC6低表达患者相比预后差（图1D）。
二、EMC6 参与许多癌症的恶性进展
1. 疾病特异性生存期DSS在33种癌症中的单因素Cox回归分析表明，EMC6的表达与多种癌症中的DSS密切相关，如BLCA（p=0.032）、CESC（p=0.01）、LGG（p=0.018）、PAAD（p=0.04）等（图2A）。正如预期，EMC6的表达对LUAD的DSS的影响仍然最强（p = 0.004）。
2. Kaplan-Meier（KM）分析结果显示，有6种癌症的DSS与EMC6的表达密切相关（图2B）。其中就包括LUAD（p = 0.023）。
3. 患者的临床分期反映了患者的临床病理特征，即肿瘤组织的恶性进展和患者的预后。因此，作者在GEPIA2数据库中检索了EMC6在33种癌症中不同病理阶段的表达，发现在KICH、LUAD和皮肤黑色素瘤 SKCM中，EMC6 的表达随着肿瘤的进展而逐渐增加；相反，在肾乳头状细胞癌KIRP和子宫癌肉瘤UCS中，EMC6的表达随着肿瘤的进展而逐渐降低（图2C）。
4. 此外，作者使用了以下两图以更好地验证结果。
图3：来自HPA数据库的生存分析数据
图4：EMC6与DNA甲基化之间的关系
三、EMC6表达与肿瘤免疫的关系
1. 为探究EMC6是否参与33种癌症的肿瘤免疫，作者对TCGA数据进行了EMC6与一系列免疫相关基因的共表达分析。热图表明，除了ACC、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)、间皮瘤(MESO)和UCS外，在几乎所有类型的癌症中，EMC6的表达与免疫激活基因（图5 A）、趋化因子（图5 B）、趋化因子受体（图5 C）和主要组织相容性复合物（MHC）（图5D）密切相关。
2. 此外还发现 EMC6 的表达与 KICH 和葡萄膜黑色素瘤 UVM等癌症的免疫反应显著正相关，与胆管癌 CHOL 和 LUAD 等癌症的免疫反应显著负相关（图 5）。
四、EMC6 在 LUAD 中的关键作用
1. 通过前期分析，作者发现EMC6参与多种癌症，特别是LUAD的肿瘤免疫应答。EMC6的表达与各种免疫相关基因呈显著负相关，表明EMC6很可能参与LUAD的免疫逃逸过程。因此首先使用来自多个GEO数据集（GSE19188、GSE44077、GSE31201和jacob-00182-HLM）的差异表达分析（图6A、B）和生存分析（图6 C、D），来确认EMC6在LUAD中的关键作用。然后在LUAD中构建了EMC6的microRNA调控网络（图6 E），并在CCLE数据库中观察EMC6在各种LUAD细胞系中的表达（图6F）。
2. 接下来通过CIBERSORT算法重新评估了EMC6与LUAD肿瘤免疫的关系。结果表明，EMC6 与 LUAD 中的肥大细胞、CD4 T 细胞、免疫评分和基质评分呈显著负相关（图 7A）。为验证分析，作者使用 siRNA 构建了 EMC6 敲低 LUAD 细胞系 A549，并使用 qPCR 验证了 EMC6 敲低的效率（图 7B）。
3. 然后作者使用构建的 EMC6 敲低 A549 细胞系进行了一系列细胞功能实验。
首先，CCK-8 测定结果显示 EMC6 蛋白水平的降低大大降低了A549的增殖能力（图 7C）。
其次，transwell测定结果显示，与正常A549细胞相比， EMC6敲低的A549细胞在同一时间内迁移和侵袭的数量明显减少(图7D)。
最后，伤口愈合试验的结果再次证明，EMC6的存在对A549的迁移能力起着至关重要的作用（图7E）。
4. 作者想探索EMC6在LUAD中的机制。在前人研究中，EMC6已被证明是自噬的关键基因，故作者推测EMC6也参与了LUAD中的铁死亡和铜死亡过程。而共表达分析表明，EMC6确实与这些与铁死亡和铜死亡相关的基因密切相关（图7F）。为使这一发现更具临床应用性，作者使用连通性图谱（CMap）来预测EMC6相关的小分子化合物及其相应的靶基因，发现“米托坦”很可能能够调节肺癌和糖尿病之间的关联。
5. 作者对LUAD中EMC6相关基因进行功能富集分析（图7G）：主要富集的KEGG通路是 JAK-STAT 信号通路、细胞粘附分子（CAMs）、丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信号通路和核糖体；主要富集的分子功能MF是核糖体和细胞因子受体活性的结构成分；EMC6的生物过程BP是前体代谢物和能量的产生以及GTP酶活性的调节；细胞成分CC是线粒体内膜和线粒体基质和受体复合物。
此外，TIMER数据库的结果表明，EMC6的表达水平对LUAD中多种免疫细胞的浸润有显著影响（图7H）。
6. 紧接着进行体内实验以更好地观察真实过程。作者构建了C57小鼠皮下激素肿瘤模型（图 8A），可见降低LUAD细胞中EMC6的表达可显著降低肿瘤的生长速度（图8 B），并显著增加肿瘤组织中免疫细胞（CD4 T细胞，CD8 T细胞和巨噬细胞）的浸润（图8C、D）。
7. 为提高本研究的临床意义，作者从HPA数据库中观察了EMC6在LUAD组织和正常肺组织中的免疫组化结果。结果显示，LUAD组织中EMC6的表达显著高于正常肺组织中的表达（图9）。
研究总结：
EMC6 是一种重要的内质网蛋白，近年来已被鉴定为参与自噬，然而作者发现只有少数研究关注EMC6在癌症中的调节作用。本研究是首个对肿瘤中EMC6进行泛癌变分析的研究，并验证和推测了其在LUAD中铁死亡、铜死亡和免疫反应的调节作用。这些发现将为内质网蛋白在肿瘤治疗中的调控作用提供新的思路和支持，同时其临床意义至关重要。
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