文献精读
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英文题目：Expandable megakaryocyte cell lines enable clinically applicable generation of platelets from human induced pluripotent stem cells
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作者：Koji Eto，2014
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期刊和影响因子：Cell Stem Cell ，IF=21.4
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实验目的
在本研究中，我们表明c-MYC和BMI1的共过表达，BMI1是一种抑制INK4A / ARF基因位点的多梳复合物成分，使来自hiPSCs或hESCs的巨核细胞系（MKCL）能够连续生长长达2个月。不稳定域（DD）载体系统使我们能够在适当的范围内控制外源性c-MYC，从而成功诱导MKCL。BCL-XL的加入使得获得可以生长超过5个月的永生化MKCL（imMKCL）成为可能，从而作为候选细胞库。当c-MYC，BMI1和BCL-XL的表达关闭时，imMKCL产生功能性CD42b（糖蛋白Ib α[GPIbα]和von Willebrand因子受体[vWF]）血小板颗粒。血小板上CD42b的表达是开始凝血和体内细菌清除所必需的。
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结论
5.1 我们发现单独c-MYC过表达或c-MYC和BMI1过表达的组合增加了表达巨核细胞CD41aCD42a的大细胞数量 。这表明BMI1的作用可能是在自我复制开始时至少抑制INK4A / ARF依赖性衰老和凋亡。
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5.2 因此，尽管BMI1抑制了INK4A / ARF途径，但高c-MYC表达可导致半胱天冬酶依赖性MKCL细胞凋亡。
因此，似乎单独表达c-MYC和BMI1，半胱天冬酶caspase活化的增加，细胞凋亡，不适合产生永生化的细胞系。
5.3 我们发现BCL-XL过表达诱导来自692D2或KhES3细胞的CD41a+细胞的指数生长。这种生长持续了5个多月，因此我们认为这些细胞是自我更新的imMKCL。这两种imMKCL在[冷冻保存]后也显示出指数的生长，以及CD41a，CD42a，CD42b和CD9表达和稍大的细胞大小。即使在100或1，000 nM Shield1存在下，即使c-MYC表达较高，这些imMKCL的生长也持续存在，并且细胞表现出相对较低的半胱天冬酶3和7激活水平，类似于Jurkat细胞。
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5.4 BCL-XL通过半胱天冬酶3和7灭活抑制细胞凋亡，并且c-MYC，BMI1和BCL-XL都是从PSC克隆诱导imMKCL所必需的。
5.5 同时过表达所有三个基因或c-MYC和BMI1的过表达，然后在14-21天后BCL-XL，从HPC阶段计数（从hESC或iPSC阶段开始28-35天。同时添加所有三个基因仅可促进最大增殖长达40-50天，而逐步添加c-MYC和BMI1，然后BCL-XL始终显示出更持久的增殖，可增殖五个月以上。长期栽培可能导致imMKCL成为致癌物
5.6 血小板上的GPIb-V-IX复合物，特别是CD42b（GPIbα）是vWF的关键结合位点，并且是血小板最初粘附到受伤血管壁以及输血后正常循环所必需的。在关闭外源诱导基因的表达后，内源性和外源性c-MYC，BMI1和BCL-XL表达均下降（图S5A），并且与MK成熟，GATA1，FOG1，NFE2和β1-微管蛋白相关的转录因子下降。 增加到与脐带血（CB）衍生的MK相当或更高的水平（图3E)
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5.7 用多西环素调节系统关闭c-MYC，BMI1和BCL-XL增加了imMKCL的CD42b产率和CD41a血小板中上调的CD42b表达。我们估计在诱导分化后每Cl-2 imMKCL-MK产生3个CD42b血小板，每Cl-7 imMKCL-MK产生10个血小板（外源表达关闭后5天；在无血清条件下，这是适合临床应用的水平。在10厘米的培养皿秤（10ml）中，4×106和 2 × 106分别从imMKCL Cl-7和Cl-2获得每毫升血小板（图4C）。因此，我们提出的系统理论上可以产生10115天内用25-50l培养基的血小板（相当于一次输血）。
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5.8. AK4抗体（抗人P-选择素）部分逆转了血小板粘附（即Cl-2血小板>60%; [图 6]，表明P-选择素有助于imMKCL血小板的初始粘附，并且内皮衍生的vWF和P-选择素在我们的小鼠模型中是相关的。
5.9. 因此，我们的结果表明，尽管imMKCL血小板在体外和体内表现出比新鲜供体血小板更小的粘附和聚集能力，但观察到的功能能力处于有用的水平，并且可以通过进一步优化培养条件和/或收集方法来潜在地改善。
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- 讨论
6.1 我们证实了在TPO和SCF存在下MK谱系永生化自我复制期间降低半胱天冬酶活性的重要性，这表明半胱天冬酶活性在先前观察到的体外MK不稳定增殖中起作用。
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6.2 BCL-XL的外源性过表达通过减弱半胱天冬酶3和7活化来促进长期自我复制，即使在存在较高的c-MYC水平的情况下也是如此，并且内源性BCL-XL可能是产生血小板的imMKCL存活所必需的。与这个想法一致，BCL-XL缺陷小鼠获得的结果表明，这种蛋白质是MK存活和血小板释放所必需的。
6.3 据报道，持续的BCL-XL过表达对MK中分界膜的发育和[血小板的产生有负面影响。然而，c-MYC依赖性MK增殖也是TPO依赖性的，并且要求BMI1在BCL-XL之前存在。
6.4 据报道，BMI1直接与结合，核心结合转录因子β，并在[巨核生成期间充当调节因子，这表明BMI1可能在imMKCL开发中具有替代功能。当BCL-XL的影响在MK增殖计划完全建立之前占主导地位时，MK增殖计划可能会被破坏。
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