什么是双荧光素酶？
双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素。其中荧火虫荧光素是从萤火虫中分离得到，分子量为61 kDa；而海肾（Renilla）荧光素酶则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36 kDa。
两种荧光素酶的区别是什么？
①底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。
②发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双荧光素酶报告实验中得到广泛应用，它们的发光原理如下所示：
原理
以上摘自https://zhuanlan.zhihu.com/p/496542976
简单来说，Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被称为报告基因，是因为在基因表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可以监控、证实微观层面上的分子间的相互作用。具体做法是：将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Firefly luciferase基因的上游，通过目标转录因子与其互作，以研究转录因子对启动子的作用。
因为最近在做这个试验，遂记录步骤，方便今后查看。
步骤
大致分为：扩增目的片段、酶切pGreenⅡ 62-sk与pGreenⅡ 0800-LUC载体、连接目的片段与酶切产物、转化DH5α、测序、转化GV3101（psoup）、侵染烟草、利用荧光素酶试剂盒检测荧光。
1.根据片段序列，设计带有酶切位点的引物。可以在https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html网站进行设计，载体线性化方式选择双酶切，输入载体完整序列和片段完整片段，输入5’和3’端接壤的酶切位点（5’与3’分别对应片段5’和3’），输入插入片段的完整序列，即可生成引物序列。
注意：根据无缝克隆要求，同源臂需要在25bp左右，GC含量在40%-60%，可根据实际情况优化引物，扩增时退火温度设置为片段引物的退火温度-5°左右。
2. 扩增片段：以cDNA/DNA为模板，使用高保真酶扩增目的片段，并切胶回收。
注意：高保真酶50微升体系，更换新的电泳液，pcr产物＋10微升 6×DNA Loading Buffer，跑胶并胶切回收，得到扩增片段。
3.酶切质粒：依据内切酶说明书，构建酶切体系，加入两种内切酶，加入质粒（1微升内切酶加入1微克质粒），在适当温度下进行酶切。得到的酶切产物＋10 微升 6×DNA Loading Buffer 跑胶，未酶切质粒5微升＋1微升6×DNA Loading Buffer作为对照跑胶。一般来说，未酶切质粒有三条带，分别为三种构象，而酶切成功的载体有一条带，且比未酶切的质粒跑得慢即长度长。将酶切后的线性载体胶切回收后，得到酶切后的载体。
4.连接。依据无缝克隆试剂盒进行连接，按照比例加入片段与酶切后载体，一定反应时间后得到连接产物，将其转化至DH5α感受态。
5. 挑取单克隆，进行菌落/菌液PCR。挑取单克隆至10微升ddH2O，混匀后吸取2微升用于菌液PCR，剩余部分中加入LB及对应抗生素，摇床扩大培养。
6. 测序。将有正确大小条带的菌液送测，比对测序结果。若测序结果与参考序列一致，则保入菌库，若不一致，则看是否为同义突变，是否影响结构域，也可以多挑几个克隆看看。
7．提取序列正确的质粒，转化至GV3101(psoup)感受态，挑取单克隆PCR验证。
注意：农杆菌不易PCR出条带，建议更换效率高的高保真酶进行扩增。
8.选取条带正确的菌液大摇，至OD为0.5-0.6，收集菌体使用重悬液重悬至OD600为0.8-1。室温避光放置2-3h后，以转录因子与启动子菌液1：1的比例进行混合菌液，注射烟草，瞬时转化，2d后取样。
9.取样。使用1ml枪头在每片叶子上进行取样。每个生物学重复叶片量为2-4片 1 ml枪头口取的圆形样品。
10.荧光测定。液氮研磨样品后每个生物学重复加入200 微升细胞裂解液，依据荧光素酶试剂盒进行操作。
（底物为试剂盒中所附萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶底物。50×萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶底物配置方法：10微升 50×荧光/海肾荧光素酶底物 +490 微升对应缓冲液。其他体积类似计算。）
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