发表期刊：Advanced Functional Materials
影响因子：16.834
文章题目：Aligned PCL Fiber Conduits Immobilized with Nerve Growth Factor Gradients Enhance and Direct Sciatic Nerve Regeneration
技术手段：转录组测序
派森诺生物与西安交通大学附属红会医院携手合作，于近期在材料科学领域国际期刊《Advanced Functional Materials》上发表了功能性神经修复材料制备及神经轴突趋化生长机制方面的研究进展。
研究背景
周围神经损伤是常见的骨科疾病，其可导致受损神经区域的感觉和运动功能丧失，甚至终身残疾。长期以来，自体神经移植被认为是临床修复长度超过10mm的周围神经缺损的方案。然而，供体神经来源有限以及供-受体神经匹配较差均限制了这一技术在临床中的应用。
随着工程技术和新生物材料技术的发展，制备功能仿生的神经导管已成为周围神经缺损的合适手段。在这一技术中，材料的形貌引导和趋化作用是周围神经再生的关键因素，即：使用具有对齐结构、有序化排列的纤维导管更有利于引导神经再生，且以往体外研究证实，神经轴突更倾向于神经生长因子浓度高的一侧延伸，因此结合了有序化排列结构和生长因子梯度分布的导管将在神经修复中达到令人满意的效果。但按传统方式制备出的纤维导管内外分层严重，力学结构差，达不到有序排列的要求，且生长因子的梯度分布也难以实现。
基于此，本研究提出了一种制备纤维结构有序、同时生长因子梯度分布的纤维导管（A/G-PCL）的方案，并通过体外实验和活体实验评估了该材料的优良性能，最终通过转录组测序进一步解释神经元趋化生长的分子机制。
实验方法
首先通过自主研发和改良的方法制备创新型A/G-PCL导管，然后从体外实验和体内实验两方面对其神经修复能力进行评估，最后通过转录组测序手段探索其神经修复机制，实验路线图见下：
其中6种纤维导管：
R-PCL 纤维结构无序，无生长因子
A-PCL 纤维结构有序，无生长因子
R/U-PCL 纤维结构无序，生长因子均匀分布
R/G-PCL 纤维结构无序，生长因子梯度分布
A/U-PCL 纤维结构有序，生长因子均匀分布
A/G-PCL 纤维结构有序，生长因子梯度分布
实验结果
1、制备A/G-PCL导管
在本研究中，作者对静电纺丝系统构建了一个平行负高压电场，从而实现了有序纤维神经导管的一体化制备。在此基础上，作者巧妙的采用溶质浓度与时间双因素梯度改变的策略，简单地实现了神经生长因子在短距离有序纤维导管中的梯度分布，最终制备出了高度对齐、结构有序、且神经生长因子浓度呈现梯度分布的PCL（A/G-PCL）纤维导管（图1）。
接下来，作者分别从体外实验和活体实验两方面评估了A/G-PCL导管支持神经突起定向延伸和坐骨神经再生的能力，并通过转录组测序对其分子机制进行了探索。
图1 A/G-PCL制造原理图
2、体外实验
将SD大鼠的背根神经节（DRG）外植体在R-PCL、A-PCL、R/U-PCL、R/G-PCL、A/U-PCL和A/G-PCL上培养72h，然后进行免疫荧光染色，并测量轴突长度。结果表明（图2），DRGs的轴突在无序的PCL纤维上多方向随机生长，而在有序的PCL纤维上轴突沿纤维方向纵向生长，且在生长因子梯度分布的PCL导管上，DRG神经突优先向最高浓度的生长因子生长，表现出趋化现象。这些结果表明，纤维的形貌在指导轴突再生方面起着重要作用，生长因子的梯度分布则促进了轴突显著的趋化生长。
图2 DRG神经突的生长和取向
3、体内实验
对雄性SD大鼠进行坐骨神经切除，留下15mm长的缺损，然后分别植入A-PCL、A/U-PCL、A/G-PCL和自体神经段，术后4周、8周和12周对大鼠进行多指标评估。形态学评估显示，A/G-PCL导管在对轴突有更强的纵向引导力，并引起施万（schwann）细胞的迁移（图3），另外在术后第12周，与A/U-PCL导管相比，移植有A/G-PCL导管的大鼠在G比、有髓神经纤维的总数和面积等方面均显现出优势，说明A/G-PCL导管可显著促进轴突再生（图4）；此外，功能学评估表明，与A/U-PCL导管相比，A/G-PCL导管组的大鼠在肌肉萎缩程度、肌肉湿重比、炎症因子水平、复合肌肉动作电位等指标均表现出明显改善（图5）。另外指标均表明，A/G-PCL的表现和自体移植物类似。
图3 各组术后再生神经形态学观察
图4 免疫组化染色和荧光金逆行示踪
图5 腓肠肌masson染色、坐骨功能指数(SFI)及电生理评价
4、分子机制探索
对在A-PCL、A/U-PCL和A/G-PCL上培养72h后的大鼠DRG提取总RNA，进行转录组测序。结果表明，相比A/U-PCL组，A/G-PCL组鉴定到330个上调基因，277个下调基因（图5 A）。对这些差异基因进行GO富集分析发现，差异基因显著富集于“神经元投射形态发生”、“神经递质分泌”、“白细胞迁移”和“细胞因子产生的调节”等条目（图5 C）。KEGG富集分析显示，上调基因富集于13条通路，下调基因富集于6条通路（图5 D），进一步利用ClueGo对上调基因进行通路分析，构建网络图，从中分析和总结了三个重要的信号通路，涉及Rap1，MAPK，和细胞粘附分子（图6）。神经元生长锥转向是一个复杂的过程，其中以肌动蛋白为基础的运动被用来产生持续和定向的微管前进。另外研究中富集的多种粘附分子可能参与生长锥引导、突触形成、髓鞘形成和轴突生长。最后挑选与这些通路密切相关的关键基因进行RT-qPCR验证，结果与转录组测序一致：A/G-PCL组的表达显著高于A/U-PCL组（图5 E）。
图6 转录组测序结果
图7 上调基因的KEGG网络图
总结
在本研究中，作者开发了一种高度对齐、结构有序、且神经生长因子浓度呈现梯度分布的PCL纤维导管（A/G-PCL），用以桥接大鼠坐骨神经缺损模型中的15mm间隙。体外实验证明，A/G-PCL可引导轴突的纵向和趋化生长。形态学和功能学评估显示，A/G-PCL也促进轴突再生和功能恢复，其表现与自体移植物相似，并优于神经生长因子均匀涂布的导管。在分子机制方面，转录组测序结果显示，A/G-PCL处理可通过19条轴突吸引相关的信号通路来指导神经再生。总之，这些结果表明，A/G-PCL纤维导管作为自体神经移植物的替代品来修复周围神经缺损具有很大的潜力。
本研究的转录组测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202002610
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