为探究小鼠大脑中的神经炎性星形胶质细胞亚型，纽约大学的研究人员利用单细胞转录组测序及空间转录组测序技术，对小鼠脑星形胶质细胞进行研究，揭示了小鼠大脑中的神经炎性星形胶质细胞亚型及其空间分布情况，相关成果于2021年10月发表于Nature Neuroscience杂志（IF：24.884）。
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小鼠脑内神经炎症性星形胶质细胞亚型
Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain
发表杂志：Nature Neuroscience（IF：24.884）；
发表时间：2021年10月；
应用技术：10x Genomics单细胞转录组测序；10x Genomics空间转录组测序；
研究背景
星形胶质细胞发挥着至关重要的稳态功能，如神经递质的摄取和代谢产物的循环，以支持活跃的神经元，并形成血脑屏障的组成部分，保护大脑免受有毒代谢物和周围环境的伤害。星形胶质细胞在感染、急性损伤和慢性神经退行性疾病后发生炎症转变。这种转变是如何受到时间和性别的影响，它在单细胞水平上的异质性，以及亚状态在大脑中的空间位置上如何分布，目前仍不清楚。本研究利用10x Genomics单细胞转录组测序和空间转录组技术揭示了高反应性星形胶质细胞的亚状态和空间分布，发现星形胶质细胞不同亚群在损伤后存在异质性。有助于重新定义我们如何研究和靶向星形胶质细胞激活状态，为后续的脑科学研究提供了重要基础。
主要结果
1. 随时间的推移，星形胶质细胞获得不同的炎症状态
为了研究星形细胞炎症状态下转录组随时间的变化，本研究将Aldh1l1eGFP报告小鼠腹腔注射脂多糖（LPS，诱导炎症）或生理盐水（对照）。LPS注射后3、24和72 h，对皮质星形胶质细胞进行荧光激活细胞分选（FACS）纯化，进行bulk RNA测序（图1a）。
结果发现大量星形胶质细胞基因在3、24、和72 h (图1 b, c) 出现表达变化，常见的星形胶质细胞标记基因Gfap和Serpina3n在所有时间点上调表达（图1e）。然而，基因表达的变化主要集中在某个体时间点（图1d），在所有时间点的743个改变基因中，只有4%被诱导。干扰素刺激基因（ISGs）在3h表达量最高（图1 e, f）。24 h时，参与血管生成和血压的基因Fbln和
Agt 以及参与细胞外基质重构的基因Timp1 上调表达（(图1 e, f）。此外，本研究还分析了炎症期间星形胶质细胞中基因表达变化的性别差异。
图1 星形胶质细胞经历快速的炎症转变，并随时间发生剧烈变化
2. 复杂的星形胶质细胞亚群占据了大脑中不同的区域
为了进一步了解星形胶质细胞的异质性，本研究接下来利用LPS和盐水注射雄性和雌性Aldh1l1eGFP小鼠，24h后利用流式细胞术纯化星形胶质细胞进行10x Genomics单细胞转录组测序（图2a）。使用细胞类型Marker去除非星形胶质细胞后，仍然有79,944个星形胶质细胞表达经典星形胶质标记基因，每个细胞的中位数为1,257个基因（图1a），共鉴定到10个亚群（图2b、c）。整体来说，细胞亚群分为灰质/上层富集（亚群0、1、3和8）或白质/深层/亚质（亚群2、4、5、6、7和9）。
为了确定这些不同星形胶质细胞亚群是否占据不同的解剖位置，本研究使用10x Genomics Visium平台对处理后小鼠（3LPS+3盐水）的大脑切片进行了空间转录组学分析，可观察到星形胶质细胞特异性基因如Gfap、S100b或Aldh1l1等的空间表达状态。结合单细胞转录组数据，确定了各个亚群在大脑切片中的位置（图2d）。
图2 通过单细胞转录组测序识别星形细胞亚型，并在盐水处理小鼠的大脑中使用空间转录组测序进行定位
3. 星形胶质细胞对炎症的反应是不同的
为探究单个细胞亚群如何对LPS诱导的炎症反应，本研究对亚群特异性差异表达基因（DEG）进行了鉴定，利用muscat软件来执行多样本、多条件、亚群特异性DEG分析（图3a-c）。结果表明所有的细胞亚群都很好的响应了LPS诱导的验证（图b-d）。LPS刺激的小鼠68%的星形胶质细胞表达LPS诱导基因Serpina3n，而对照组小鼠的星形胶质细胞只有3%表达。大多数基因在亚群中显示出复杂的协同调控，在9个亚群中共有45个DEG（图3c）。
另外，为研究不同亚群中炎症基因随时间的变化，本研究为每个亚群创建了炎症基因模块，并使用bulk数据确定了它们的轨迹（图3e）。
图3 在星形胶质细胞中炎症引了起异质、亚群特异性的转录组反应
4. 星形胶质细胞的活性亚群占据着不同的解剖位置
虽然所有星形胶质细胞簇对LPS有反应，但亚群4显示了最独特的DEG，而亚群8在炎症基因方面定义最明确，并表现出较强的早期炎症反应，因此，接下来本研究这两个亚群进行了更深入的研究。
在所有已测序星形胶质细胞中，亚群4占5.9%，主要由炎症标志物Timp1、Gap43、Hspb1、Lcn2和Gfap定义。亚群4还表达了干扰素诱导的典型基因，包括Psmb8、Ifitm3和抗原呈递相关基因：H2-K1、H2-T23和H2-D1（图4a–c）。利用10x Visium空间转录组技术研究发现，无论在实验组还是对照组中，存在于Gfap+白质束，包括胼胝体，以及第三和侧脑室之间（图2d和4d）。对亚群4的基因模块进行分析，发现LPS处理的所有切片中的强诱导（图4e）。此外，亚群4还高表达Aqp4、Gfap、Vim以及深层/白质基因Id1、Id3和Id4。作者还使用RNAscope验证了这些细胞确实是星形胶质细胞（图4f)，并在靠近脑室的白质束中发现Timp1+星形胶质细胞（图4g-j），表明亚群4的炎症成分可能是由通过脑室的外周信号诱导的。
图4 亚群4是位于白质中的超级炎症响应亚群
不同于亚群4，亚群 8对LPS的响应更强烈、更早，并且亚群8几乎只在实验组中出现 （图5 a、d），即使这样，亚群8也只占测序星形胶质细胞的2.7%，并且主要由炎症基因定义。除此之外，亚群8中其他基因主要富集在抗原处理和呈递以及IFN诱导的GTPases中（图5b,c），这表明这些星形胶质细胞暴露于干扰素并增强了抗原提呈能力。空间转录组数据揭示了亚群8的空间位置，即侧脑室和第三脑室周围、海马下方以及脑表面（图5d）。同样地，作者也使用了RNAscope对这些结果进行验证（图5f-h）。
图5 亚群8的基因表达特征和空间定位
5. 疾病模型中的干扰素反应性星形胶质细胞
因为亚群8具有明确的炎症特征，本研究探究了亚群8型星形胶质细胞是否存在于其它具有炎症成分的疾病模型中。通过对本研究数据、前人发表的阿尔茨海默氏病的5XFAD小鼠模型数据、多发性硬化症的小鼠模型（EAE）数据、急性刀伤损伤模型数据等多个单细胞测序数据进行整合分析，发现在人类慢性疾病的小鼠模型（5xFAD和EAE）中，在单独分析数据时没有发现亚群8型星形胶质细胞，这可能是由于该亚群的比例低（~2.7%），并且这些研究中测序的星形胶质细胞数量较少。然而，将这些数据集与本研究的数据整合时，则能够将这类占比很小的星形胶质细胞亚群识别出来。在5xFAD小鼠中，星形胶质细胞表达亚群8基因，它们的表达部分依赖于Trem2（图6a-c），这再次强调了该亚群与免疫细胞在驱动这种反应中的重要相互作用。同时，也在EAE大脑中发现了亚群8型星形胶质细胞，它跟随疾病状态在幼年小鼠中较低，在急性期最高，在缓解期间回到基线水平（图6d-f）。最后，在刺伤损伤的小鼠模型中也可以找到亚群8型星形胶质细胞（图6g-i）。
图6 在疾病/损伤小鼠模型中识别干扰素反应性星形胶质细胞
研究结论
在本研究中作者使用细菌细胞壁内毒素脂多糖研究小鼠皮质星形胶质细胞在急性炎症刺激后的转录组变化。发现星形胶质细胞的转录组变化发生在数小时内，随着时间的推移急剧变化。通过对约80,000个星形胶质细胞进行单细胞转录组测序，发现炎症引起广谱的反应，亚型星形胶质细胞经历了不同的炎症转变，并具有明确的转录组特征。利用空间转录组学和原位杂交技术将炎症诱导的反应性星形胶质细胞的关键亚状态锚定大脑区域。总之，数据集为分析星形胶质细胞异质性提供了强大的资源，并将有助于理解局部受限反应性星形胶质细胞亚状态的生物学重要性。
参考文献
HaselP, Rose IVL, Sadick JS, Kim RD, Liddelow SA. Neuroinflammatory astrocytesubtypes in the mouse brain.NatNeurosci.2021;24(10):1475-1487.
李超 | 文案
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