分子生物学中的DNA“链”

在进行生信分析的过程中，经常会被基础的分子生物学概念所困扰，如在学习RNA-seq的链特异性建库（rf (fr-firststrand)；fr (fr-secondstrand))时所涉及到的链。因此写一篇关于链的小杂，并附带简单介绍RNA-seq的链特异性建库，加深对链的印象和理解。

（1）正链和负链

在刚接触双链DNA时，老师就经常告诉我们，一条是正链(forward strand)，方向是从左往右（左为5‘，右为3'）。而另一条链则是负链（reverse strand），从右往左（左为3’，右为5‘）。其实基因组正负链的定义只是在基因组拼接完成后被认为指定的。正链即基因组文件中的DNA序列，而与之反向互补的序列则为负链的DNA序列。也正是由于是人为指定的，所以做两个近缘物种间的全基因组共线性分析时，经常会看到整条染色体出现倒位的情况。其实这种现象是由于指定不同的链作为正链导致的。

Double DNA strand

（2）正义链sense strand（非模板链，编码链）和反义链nonsense strand （模板链，非编码链）

正链和负链是由人为指定的，而正义链，反义链则不然，该定义则是基于与hnRNA（mRNA前体序列）序列的关系决定的。如下图所示，在hnRNA的转录过程中，与hnRNA反向互补的DNA链（换句话说，基于此链合成hnRNA的）称之为模板链，反义链，和非编码链。而hnRNA序列相同的链则称之为非模板链，正义链，和编码链，此链存储着mRNA的编码信息。

Coding and template strand

warning：在基因组上，所有基因的正义链并不都是在同一条链上，而是同时存在于正链和负链上！！！

（3）常见的基因组文件与“链”的关系

genome.fa：基因组文件，存储着物种全基因组的DNA信息，该文件中的DNA序列为基因组中的正链序列

transcript.fa：转录本文件，去除内含子后的RNA序列。存储着物种所有基因的mature mRNA序列，该序列携带的信息与正义链相同。

CDS.fa：编码序列文件，编码氨基酸的RNA序列，去除UTR非翻译区的mature mRNA序列。其与transcript.fa的唯一区别是不含UTR区。

CDS, exon, intron, and UTR

（3）RNA-seq——链特异性建库

【1】普通的转录组测序

提取的mRNA先反转录生成cDNA序列，DNA聚合酶合成互补的cDNA序列从而得到双链的cDNA，随后进行纯化富集进行建库。末端加A使得平末端转化为粘性末端便于后续加引物和接头。因此文库中即包含了目的mRNA序列，同时还包含了与目的mRNA序列反向互补的序列。因此在测序完成后得到的下机数据中我们并不能将其进行区分。

【2】链特异性转录组测序，链特异性测序的关键点在于其在合成的双链cDNA后，可以选择性的保留一条链。如中间的图所示。其在合成第二条cDNA链时将dTTP改成了dUTP, 在末端加A并添加完接头和引物序列后，使用UDGase酶可以特异性的在尿嘧啶U的位置上产生单核苷酸的缺口，从而消化掉第二条链，特异性的保留cDNA的第一条链。因此在后续的建库测序过程中，测到的下机数据均来自于cDNA的第一条链！