文献学习011--[sc]从单细胞水平解析炎症和纤维化在心衰中的

这一篇是阜外的宋江平老师和北大的张泽民老师合作的文章，最近发表在Basic Research in Cardiology上面。

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Abstract

炎症和纤维化是心衰的发生过程中两个错综复杂的根本机制。对白细胞和非心肌细胞基因表达异常情况和细胞互作情况的解析有助于理解衰竭心脏中细胞特异性病理状态。为此，该研究对来自DCM（扩心病）患者和ICM（缺血性心肌病）患者心脏的200615个细胞进行了单细胞测序和TCR测序。为了探究不同纤维化情况下心脏的细胞和分子改变，每个心脏的病变区和轻度病变区组织均被采集。
一个新的转录因子AEBP1被鉴定为ACTA2⁺肌成纤维细胞的关键心肌纤维化调控分子。在出现纤维化的心肌中存在大量白细胞浸润，尤其是细胞毒性和耗竭CD8⁺T细胞和促炎CD4⁺T细胞。此外，一类CXCL8^hiCCR2⁺HLA-DR^hi的组织原位巨噬细胞特异性的出现在严重纤维化区域。这类细胞可能通过DARC与活化的内皮细胞相互作用，参与心衰时白细胞的招募和组织浸润。

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1. Major cell types in the human heart revealed by scRNA-seq（标准的细胞整合图）

Fig 1A, Fig 1B（实验流程）：
3个DCM患者和2个正常对照去了左心室，右心室和血样本；
3个ICM患者取了梗死灶，非梗死灶和血样本。
所有的血样本都经过了CD45⁺流式分选，所有的心脏组织样本都经历了CD45⁺和CD45^-的流式分选。

CD45^-细胞分选：
CD31：内皮细胞的marker
DARC：红细胞、内皮细胞和上皮细胞表达

Fig 1C：DCM，ICM和对照的心脏组织HE染色图

Fig 1D E F：流式分选图；所有细胞整合图；细胞marker基因表达图

⚠️这篇文章是做了一轮聚类和大群注释之后重新对每个细胞群进行聚类和亚群注释。
大群注释：FindNeighbors用了30个PC；FindClusters的resolution=0.5；RunUMAP用了“umap-learn” method(默认)，设置“n.neighbors”为40L(默认是30L，可以为5-50), “dims”=1:30，“min.dist”=0.3(默认)。
FindAllMarkers的参数设置：'min.pct' = 0.3，“logfc.threshold” = 0.6
亚群细分：FindNeighbors的PC：15-25，“FindClusters” 的resolution：0.3-1.2. 具体情况具体分析

2. AEBP1 is a new cardiac fibrosis regulator that functions in activated fibroblasts and myofibroblasts

这一部分对成纤维细胞进行了详细分析，鉴定出了一个可以活化成纤维细胞和肌成纤维细胞的转录因子AEBP1 ✨这一部分的思路值得学习（Fig2 A-D: 细分亚群-- Fig2E: monocle找在成熟亚群中高表达的marker--Fig2F G: 验证与表型的相关性-- Fig2H I: 找这个基因的在成熟细胞里的共表达基因，看是否有与表型相关基因/做通路富集看与表型相关性）

Fig 2A, 2B, 2C：成纤维细胞亚群细分（分了8个亚群）；比例变化；8个细胞群的marker基因热图
Fig 2D：ECM assembly和Fibroblast proliferation评分计算，用的是AddModuleScore

Fig 2E：monocle2拟时序分析发现AEBP1在activated FBs和activated myoFBs中高表达（其实也就是寻找拟时差异基因，再从中挑感兴趣的来验证）
Fig 2F：15个正常心脏和52个心衰心脏的bulk RNAseq显示AEBP1在心衰心脏高表达，且其表达和纤维化marker COL1A2和POSTN正相关
Fig 2G：AEBP1在心衰心脏中的表达，免疫荧光染色验证（和2F说明了同一个东西，这个是蛋白水平）
Fig 2H：在activated FBs和activated myoFBs中找AEBP1的共表达基因，做GO富集，发现富集到ECM production and organization（和表型相关）⚠️共表达基因是用CoRegNet做的。
Fig 2I：分别展示activated FBs和activated myoFBs中AEBP1的共表达基因，发现有促炎基因FAP, POSTN, 和THBS4以及ECM基因VCAN, BGN, COL1A2和ELN (标黄)，推测这些基因在activated FBs和activated myoFBs中可能作为AEBP1的targets。（cytoscape做的）

3. An infiltration of dysfunctional CD8+ T cells and pro-inflammatory CD4 + T cells within lesion site accounts for cardiac inflammation.

首先分析了心脏和血的T细胞（Fig S3）

Fig S3A, 3B, 3C：T细胞分群umap图，比例图和marker基因展示图。提示CD4⁺T和CD8⁺T比例增加 。在Fig S3A的右图中可以看到，血中的T和组织中的有蛮大差异
⚠️这里 ILC和γδT是怎么注释的？？Methods，正文和附件都没写？？？

Fig S3D, 3E：CD4⁺T和CD8⁺T的差异基因热图（DCM左室和右室比，ICM梗死和非梗死比）发现DCM左室和ICM梗死区的CD4⁺T和CD8⁺T多种趋化和促炎基因上调
Fig S3F：CD69，一个经典的tissue-residency marker，在大部分的心脏T细胞中表达
所以心脏浸润的T细胞需要更深入的转录分析
Fig S3G：对两例DCM患者的LV和血样本，一例ICM的梗死区和血样本进行了CD3⁺细胞分选，然后做了5‘免疫组库测序

然后分析了按Fig S3G富集之后的心脏和血中的T细胞（Fig 3）
Fig 3A：注释得到25个T细胞亚群

• CD8⁺：T_N T_CM T_EM(blood&tissue) T_EFF T_EMRA T_EX (7群)
  (T_CM和T_EFF只存在于血样本，T_EMRA T_EX只存在于心脏组织样本)
• CD8⁺：UN C1, UN C2, UN C3, UN C4 (不知道是啥的CD8T 4群)
• CD4⁺：T_N T_CM T_EM T_EFF T_RM CD4⁺CD28^low(blood&tissue) (7群)
• 其他：ILC(blood&tissue), NKT(blood&tissue), proliferating cells, Treg, T_FH (7群)
  这个注释真是非常有张泽民老师的风格，和18年的那两篇结直肠癌和肺癌的nature注释方法类似，也用了STARTRAC。具体怎么注释的可以研究一下Supplementary Table 2，也可以参考免疫细胞注释：T细胞

Fig 3B：左边三个图：7群CD8⁺T细胞分别计算了耗竭，毒性和分裂评分（用的AddModuleScore），发现大体上CD8⁺ T_EFF, CD8⁺ T_EMRA, blood T_EM, T_CM, tissue T_EM and T_EX cells呈现一个毒性下降，细胞周期停滞的一个连续状态；最右边那张图：各个CD4⁺T细胞亚群的促炎评分没有明显变化。

Fig 3C：使用STARTRAC计算了各个CD8⁺T细胞亚群的expansion, migration, transition评分（STARTRAC这个工具出自张泽民老师18年那篇结直肠癌的nature）。发现CD8⁺ T_EFF和 CD8⁺ T_EMRA高度proliferative并且有很高的STARTRAC migr scores，提示效应CD8+T细胞可能活跃的向心脏组织发生迁移并扩增。
Fig 3D：根据TCR克隆来分析CD8⁺T细胞的developmental connection，发现只存在于血里的CD8⁺ T_EFF经历了广泛的状态变化并且向仅存在于心脏组织中的CD8⁺ T_EMRA分化
Fig 3E：使用STARTRAC对CD8⁺T细胞做的Pairwise transition analysis，颜色越深的色块提示两种细胞间的转化可能越大。
Fig 3F：用monocle推断了CD8⁺T细胞亚群的分化关系（supplement里还做了velocity，一个意思，只是用多种方法验证），提示CD8⁺ T_EFF(血) --> CD8⁺ T_EMRA(组织) --> CD8⁺ T_EM(组织) --> CD8⁺ T_EX(组织)这样一个迁移和分化过程，为衰竭心脏中细胞毒性CD8⁺ T细胞逐渐丢失了效应功能并出现耗竭提供了直接证据。

Fig 3G H I：这三张图和Fig 3C E F一样的，只是把CD8⁺T换成了CD4⁺T。结果提示只在 ICM样本中存在的CD4⁺CD28^low细胞具有最高的expa, migr和tran评分(G)，而且可能和T_EM存在分化关系(H)。拟时序(I)和速率分析(附件)提示CD4⁺CD28^low细胞和促修复的CD4⁺T_RM独立的分化为细胞毒性更小但促炎性更强的CD4⁺T_EM，最终引起终末期心脏衰竭。

综上，衰竭心脏中细胞毒性CD8⁺T出现毒性减低和耗竭，CD4⁺T则从修复性的细胞向更加促炎的细胞转化。因此阻断CD4⁺T促炎转变可能会对减轻炎症反应和抑制纤维化有益

4. CCR2⁺HLA^-DR^hi macrophages are major tissue-resident immune cells promoting inflammation in failing hearts

Fig 4A：组织中的髓系细胞分为13群：

DCs：pDC, DC, Inflammatory DC
Mast cell
单核：CD14⁺ Mono, CD16⁺Mono
巨噬：
组织原位：CCR2^-HLA-DR^hi C1, CCR2^-HLA-DR^hi C2,
CCR2⁺HLA-DR^hi C1, CCR2⁺HLA-DR^hi C2, TREM2⁺ Mp
趋化来的：CCR2⁺HLA-DR^hi C3
其他：增殖巨噬

Fig 4B：比例统计：CCR2^-HLA-DR^hi C1/C2在DCM RV和ICM NMI比较多，CCR2⁺HLA-DR^hi C1/C2 主要分布在DCM LV和ICM MI。
Fig 4C D：做了CCR2^-HLA-DR^hi C1/C2和CCR2⁺HLA-DR^hi C1/C2的差异基因和富集，结果显示：
CCR2^-HLA-DR^hi C1高表达一些负性免疫调节(LILRB5, MAF, SIGLEC1)，tissue-residency (LYVE1)和稳态(SLC40A1, BLVRB, STAB1, DAB2)基因；
CCR2^-HLA-DR^hi C2中模式识别受体(CLEC4E, CLEC7A, and CLEC10A)上调；
CCR2⁺HLA-DR^hi C1显示出比较强的吞噬能力(C1QA and C1QB)；
CCR2⁺HLA-DR^hi C2高表达NLRP3炎症小体和NF-kb信号通路
提示CCR2^-HLA-DR^hi C2和CCR2⁺HLA-DR^hi C2是更促炎的组织原位巨噬

这个做法是直接比较不同组织原位巨噬细胞之间的差别，看起来是为了说明不同组织原位巨噬细胞具有不同的功能。
如果这个数据是我分析的话，我应该直接就把CCR2^-HLA-DR^hi的两群并在一起，把CCR2⁺HLA-DR^hi的两群并在一起了，或者直接把五群组织原位巨噬细胞放一起计算差异基因和通路富集画雷达图，不会这样分别比较比较亚群间的差异。
感觉这样两两比较又放在一起说，有点奇怪

Fig 4E：值得注意的是，CCR2⁺HLA-DR^hi C2中CXCL8(pro-angiogenic chemokine)表达显著更高
Fig 4F：CXCL8的高表达在bulk RNAseq数据中也得到了验证
Fig 4G：组化验证CXCL8的高表达

D图里面这么多高表达的趋化因子，怎么就挑了Cxcl8出来呢？

这些结果提示CCR2⁺HLA-DR^hi C2在衰竭心脏中起到促炎作用

Fig 4H：对5群组织原位巨噬细胞，1群趋化来的巨噬细胞和CD14⁺单核细胞做了拟时序和速率分析(在附件)推断巨噬细胞间的分化关系，结果提示CCR2⁺HLA-DR^hi C3和TREM2⁺巨噬可能潜在的和组织原位巨噬CCR2⁺HLA-DR^hi C2存在分化关系，速率分析提示CCR2⁺HLA-DR^hi C2可能来源于CCR2⁺HLA-DR^hi C3和TREM2⁺巨噬。这个分化的过程可能受到转录因子ATF3和KLF4的调控。（既往有文献报道这两个转录因子调控巨噬细胞分化）
Fig 4I：SCENIC分析也提示ATF3和KLF4主要调控CCR2⁺HLA-DR^hi C2

这一部分主要是在前面鉴定出CCR2⁺HLA-DR^hi C2是促炎亚群，后面通过拟时许和velocity看了它是哪里来的。（⚠️但是这里也没有比较外周血趋化来的巨噬也就是C3和CCR2⁺HLA-DR^hi C2的促炎能力强弱啊，按照既往报道，外周血趋化来的巨噬应该比组织原位巨噬细胞促炎能力更强才对。直接两两比较组织原位巨噬细胞就得出了CCR2⁺HLA-DR^hi C2是主要的促炎群，感觉说不过去。而且病变组织中外周血趋化来的促炎细胞群还在向组织原位巨噬细胞分化，感觉从免疫的角度来讲很奇怪）

5. EC remodeling is witnessed and activated EC with leukocyte recruitment potential is enriched in severely fibrotic myocardium

作为人类心脏组织中的重要细胞成分，除了促进血管生成，ECs还可以调节白细胞浸润和心脏组织的炎症反应。

Fig 5A：ECs的注释，提示vascular ECs是心脏ECs的主要成分，而lymphatic ECs仅占很小一部分。
Fig 5B：拟时序分析提示activated EC存在独特的cell fate，一些分子只在activated EC表达
CEBPD：参与激活多种炎性基因的转录
NR2F2：master regulator that induces venous fate and antagonizes arterial fate
VCAM1, SELE, SELP：参与白细胞招募
DARC(Duffy antigen receptor for chemokines 图在附件)
提示activated EC的白细胞招募潜能
Fig 5C：activated EC的内皮活化评分明显高于其他EC
Fig 5D：免疫荧光证实DARC⁺EC的存在

ECs这一部分正文Fig都集中在activated EC，Fig 5A中的其他类型ECs，在附图中仅仅根据高表达基因和功能富集结果对其功能进行了推测

6. CXCL8^hi CCR2⁺ HLA-DR^hi macrophage interacts with activated endothelial cell via DARC, which potentially facilitate leukocyte recruitment and infiltration in heart failure.

Fig 5E F：cellphonedb做细胞互作，整合了highly expressed 受体-配体对。DCM LV和ICM MI细胞中CCR2⁺ HLA-DR^hi 巨噬和activated ECs高度相关，提示可能的互作关系，CXCL8-DARC是这两类细胞top的互作受体配体对。
Fig 5G：组织染色验证
Fig 5H：分离activated ECs用CXCL8干预后打bulk RNAseq验证
Fig 5I：CXCL8 could activate endothelium and potentially enhance leukocyte infiltration.
主要的逻辑还是CCR2⁺HLA-DR^highC2高表达了Cxcl8，和内皮上的DARC互作，起到了促进CD14⁺单核趋化到心脏分化成CCR2⁺HLA-DR^highC3

主要发现：
(1) Fibroblasts underwent extensive phenotypic remodeling in human failing heart, AEBP1 could be a novel cardiac fibrosis regulator mainly functions in POSTN⁺ fibroblast and ACTA2⁺ myofibroblast.
(2) Massive cytotoxic CD8⁺ and pro-inflammatory CD4⁺ infiltrated into failing heart, however, CD8⁺ T would ultimately become exhausted and CD4⁺ T would transit into a more inflammatory status.
(3) As major tissue-resident immune cells, a subset of CXCL8^hiCCR2⁺HLA-DR^hi macrophages preferentially locate in severely fibrotic myocardium and facilitate leukocytes recruitment and inflammation.
(4) A unique subset of DARC⁺ EC associates with cardiac fibrosis and would interact with CXCL8^hiCCR2⁺HLA-DR^hi macrophages in human heart failure. This crosstalk could potentially facilitate leukocyte infiltration, aggravate sustained cardiac inflammation and further deteriorate cardiac function.