ilumina公司的二代测序使用的是边合成边测序和四色荧光可逆终止反应的方法。
四色荧光可逆终止反应中3’blocked reversible teminator reaction（3‘端可逆终止反应） 的特点是：每个循环中加入的dNTP的3’端都有叠氮基团修饰，保证每次合成链上只加入一个碱基。这个叠氮基团的稳定与否，往往会产生两种错误信号，这些错误信号就是测序种噪音的来源，如下图所示：
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- 第一种被称为Phasing，主要因为酶活性不足无法去掉3’端的叠氮基团：在进入下一次循环后，如果上一个加入的碱基的3’端的叠氮基团未去掉，那么这一次循环中这个合成链就无法延伸，捕捉到的荧光信号还是上一个循环中的，而不是该位置的；
- 第二种被称为Prephasing，主要因为叠氮基团在有机化合物中并不稳定：在一次循环中，合成链上加入的那个碱基的3‘端无叠氮基团，那么这一次循环中合成链上延伸部分的碱基就会多于1个，那么捕捉到的荧光信号就不是该位置的。
综上，在图中正确的荧光信号是蓝色，但是由于phasing和prephasing的存在，混有了红色和黄色的荧光信号，这种信号也被称为噪音。在每次循环后进行激光扫描时，正确的信号和噪音都会被扫描到。
在ilumina测序中，一个簇一般有5000～10000个分子。例如，每个簇有5000个分子，那么理想情况下这5000个分子在一次循环中都只延申一个碱基，但总有一部分分子没有延申，这样越到后面这样的分子越多，信号的可靠性就会越差。一般来说，12个循环后一般就要考虑phasing和prephasing对信号的影响。
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