前言
关于流式实验，有的同学说，今天简单地检测一下细胞凋亡，就不需设置空白对照和单染对照，根据未处理组设定就行；然而也有人说，你这样的对照设置是不可取的。那么有关流式实验的对照设置，你的心中是否存在一些疑惑呢？实际上，对照在任何实验中都是必不可少的，尤其在流式细胞术中，只有合理对照才可以将实验结果和背景区分，排除非特异性的效应，获得高质量的数据。所以单一阳性对照已经很难满足其实验要求，只有对照设置的越充分，得到的实验结果才会越精准。
首先，我们需要了解非特异性信号产生的原因
比如常见的肿瘤细胞自发荧光，会造成背景信号干扰；又如，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和B细胞上，Fc受体均呈现高表达，在染色过程中抗体Fc端与细胞表面Fc受体的结合以及抗体与细胞的物理结合与粘附等，在这些细胞可能通过Fc结构域而不是抗原特异性Fab结构域与抗体发生结合，造成非特异性染色的发生；除此外，样本中的死细胞不仅具有更强的自发荧光，而且更容易产生非特异性抗体的结合，造成假阳性。为了避免上述情况，在流式抗体染色前需要使用Fc受体阻断剂和鉴别死细胞的活性染料对Fc受体及死细胞造成的非特异性染色加以去除。
除此之外，我们还需要根据实验具体情况设置五种对照来排除非特异性信号，下面将逐一讨论：
1. 空白对照（未染色对照）
对于细胞的自发荧光，可以设置空白对照用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，如图1所示：先去除黏连体，再经FSC-SSC图寻找到目的细胞群，然后圈出活细胞（图1 a），接着依据空白对照细胞自发荧光的强度确定阴性细胞群的位置，电压偏小阴性细胞群左侧会压线，电压过大，背景信号增加（图1 b）。
图1：空白对照及电压的调节（图片来自于网络）
2. 同型对照
在流式细胞术中，染色的背景水平是一个重要的影响因素，特别是在为罕见的低表达或者连续表达的细胞建立多色模板时，需要设置同型对照，同种型对照的作用是消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体及静电结合而产生的背景染色。
如图2 a所示荧光组成为：细胞自发荧光；如图2 b所示荧光组成为：细胞自发荧光和非特异性标记荧光（抗原和同型对照抗体的结合）；如图2 c所示荧光组成为：细胞自发荧光、非特异性标记荧光和特异性标记荧光（抗原和正常抗体的结合）。
图2：Fc受体、抗原和抗体结合的示意图
举例：下面以活化指标CD38为例阐释同型对照的重要性，图3灰色曲线为未染色样本，黄色曲线为同型对照，红色曲线为特异性抗体染色，如果在没有同型对照的情况下，以未染色样本的阴性峰最低位置划门，阳性信号的比例为95%，当以同型对照阴性峰最低位置划门，阳性信号的比例变为80%，阳性信号波动范围达到15%，这将会对实验数据的准确性造成极大干扰。
图3：空白对照和同型对照的比较（图片来自于网络）
如何选择同型对照？
一般选择相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记但由未免疫动物血清纯化而来的抗体，比如抗鼠的CD11b BV711标记的抗体，成份是Rat IgG2b, κ。那么相应的同型对照应该是BV711标记的Rat IgG2b, κ Isotype Control。此外，需要注意的是，有些抗体的浓度和同型对照抗体的浓度不一致，使用时，应当以相同剂量为准。
在一些特殊情况下，我们可能会选择纯化的一抗＋荧光标记的二抗的组合形式，这种情况下，应该选择一抗的同型对照，比如：COX-2的纯化抗体，成分是Mouse IgG1,κ，其同型对照是纯化的Mouse IgG1,κ，荧光二抗是BV421标记的抗小鼠IgG1，染色方案如下：样本管：纯化的COX-2＋BV421标记的抗Mouse IgG1(二抗)＋样本；同型对照管：纯化的同型对照＋BV421标记的抗Mouse IgG1(二抗)＋样本。
3. 单染和补偿对照
由于荧光素发射光不是一个单一的波长，而是覆盖一定范围，所以会有荧光渗漏到邻近波长的检测器，多色流式实验时，测量的颜色越多，越容易发生荧光渗漏，单染对照可以显示出不同荧光团之间光谱重叠的水平，并据此去除或补偿它们之间的重叠。
举例：与空白对照原理相似[1]（图4 a），根据单染对照细胞的荧光强度确定阳性细胞群的位置，电压偏小时，阴性细胞群与阳性细胞群不能区分开，电压过大时，细胞过于离散导致背景信号增加（图4 b），图4 c和4 d分别显示出APC-H7和Ax700以及B-530和B-585之间有补偿，补偿调节的目标是使单阳性群体的阴性指标MFI（平均荧光强度）和阴性群体的阴性指标MFI一致，在流式图上最终呈现出“横平竖直”的形状（图4 c右和图4 d中），图4 d左为补偿没有调节到位，图4 d右为补偿调节过度，有时根据单染对照和样本确认补偿适当后，由于样本之间的差异或者操作不当，样本会出现图4 e中FITC通道的阳性细胞群偏向PE通道，此时，可以在上机检测时单独对这个样本进行补偿调节。如果图4 e中，FITC标记Annexin V，PE标记PI，检测细胞凋亡，出现图4 e中的情况，在未调节补偿的情况处理数据，那么很可能导致早期凋亡细胞的比例降低，而晚期凋亡细胞的比例增加。
图4：单染对照及补偿的调节（图片来自于网络）
4. 荧光减一对照(FMO)
荧光减一对照(Fluorescence Minus One，FMO)是指实验设计里的所有荧光减去一个荧光后染色的细胞样本。多色流式实验中，检测指标越多，越容易发生荧光溢漏，这非常影响设门的准确性，尤其是表达水平极低、需要从较大比例的阴性群体中识别阳性信号时，为了排除干扰信号，确定设门的准确性，FMO便显得尤其重要。
① FMO排除干扰信号：
举例：多色流式实验中，有时，不可避免的会选择发射波长相近的荧光抗体，如图5 a所示，AF700单独检测IFN-γ，峰形图正常，而当荧光染料超过10种以上，此时，AF700检测IFN-γ，可能出现图5 b的峰形图，阴性峰的背景过宽，延伸到负轴以下，这样的图形明显不正常，可能与补偿有关，分析染色方案后发现BV711和AF700的发射波长比较接近，两者之间补偿比较大，可以增加一个BV711 FMO样本，此时，如图5 c显示IFN-γ的峰形图变成正常，因此，通过FMO样本的使用，我们可以排除干扰信号，得到正确的流式图。
图5：FMO排除干扰信号（图片来自于网络）
② FMO确定圈门的界限：
举例：在一个多色流式实验中，如图6 a所示的4种荧光标记，如果仅有空白对照和单染对照，依据空白对照进行圈门，圈门的界限将是图6 b两条横线中偏下的横线，如果在空白对照和单染对照的基础上，增加一个PE通道的FMO，此时，圈门的界限将是图6 b偏上的横线，那么FITC和PE双阳性细胞群的比例将明显降低，这将影响实验结果的准确性[2]。
图6：FMO确定圈门的界限[2]
5. 生物学对照
生物学对照即我们所有实验都需设计的对照组，可以理解为文献中的Control或者是Vehicle组。如细胞内染色实验涉及固定和透膜，这些步骤会影响抗原检测，自发荧光，荧光素亮度和细胞形态，生物学对照显得更为重要。
举例：在细胞因子释放的检测实验中，未刺激和完全刺激的样品对于确定细胞因子的动态变化是很重要的，比如，PMA和Ionomycin刺激CD3+ T细胞，活化的CD3+ T细胞分泌IFN-γ，Golgi plug抑制IFN-γ的胞外转运，4 h后，收集样本，流式检测IFN-γ的表达情况，图7 a只加入Golgi plug，作为生物学对照未刺激组，IFN-γ的比例只有0.21%，而图7 b 加入PMA、Ionomycin和Golgi plug，作为完全刺激组，IFN-γ的比例有13.9%，IFN-γ的表达明显增加，图7 c 加入PMA、Ionomycin、Golgi plug和药物，作为药物处理组，IFN-γ的比例增加到25.5%，因此，图7可以确定细胞因子IFN-γ的动态变化。
图7：细胞因子IFN-γ的流式检测
通过以上分析，我们可以发现，对照的正确应用能够使我们的实验结果更为清晰与准确。在流式实验，尤其是多色流式中，对各种对照的充分理解与恰当应用是实验取得成功的前提，也是对实验者综合水平的一大考验。愿大家能够从本文中有所收获，得出准确、漂亮的流式实验数据。
参考文献：
[1]Chen G, Huang A C, Zhang W, et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response[J]. Nature, 2018, 560(7718): 382-386.
[2]Perfetto S P, Chattopadhyay P K, Roederer M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system[J]. Nat Rev Immunol, 2004, 4(8):648-55.
来源：原创： Eliza 邦耀实验室
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