Classifying gastric cancer using FLORA reveals clinically relevant molecular subtypes and highlights LINC01614 as a biomarker for patient prognosis
利用FLORA对胃癌进行分类，揭示了临床相关的分子亚型，并强调了LINC01614作为患者预后的生物标志物
发表期刊：oncogene
发表日期：2021 Mar 19
影响因子：7.971
DOI: 10.1038/s41388-021-01743-3
一、研究背景
胃癌(GC)的分类对于解决肿瘤间异质性、预测临床结果、为不同患者定制治疗方法至关重要。基于GC的组织学或分子特征的方法已经被提出。以肿瘤组织学为基础的Lauren分类，将GC分为弥漫型或肠道亚型。癌症基因组图谱（TCGA）提出了分子亚型系统，将GC分为Epstein-Barr病毒阳性（EBV）、微卫星不稳定（MSI）、基因组稳定（GS）、染色体不稳定（CIN）和低突变-单核苷酸变异（HM-NV）亚型。
近年来，lncRNAs（定义为长度超过200个核苷酸的非编码RNA）被广泛研究，揭示了其在肿瘤进展、转移和耐药中的多样化功能。与编码基因相比，lncRNA的表达水平普遍较低，且往往具有较强的时空特异性。
二、材料与方法
1 数据来源
1）407个TCGA样本的全转录组测序数据（375个GC和32个肿瘤相邻样本）
2）靶向DNA测序数据从ACRG研究下载
3）拷贝数数据从GSE62717下载
2 FLORA工具箱
FLORA被开发成一个用户友好的命令行工具，它包括几个独立的组件。
1）从bam文件中删除映射到编码区和其他自定义基因组位置的读数，删除映射质量低的读数
2）从预处理的数据中构建转录组
3）从组装的转录组中识别出潜在的lncRNAs
4）注释lncRNAs，与已知基因组特征无重叠的lncRNA表达位点被定义为新颖
5）构建基因共表达网络，预测lncRNA的功能
3 分析流程
1）使用FLORA工具重新分析了407个TCGA样本的全转录组测序数据
2）计算基因表达，归一化为FPKM
3）用DESeq2进行差异表达分析
4）分子亚型鉴定：R包'ConsensusClusterPlus'
5）建立了三个支持向量机（SVM）分类器来分别预测一个样本是L1、L2还是L3
6）生存分析，Cox回归分析
7）拷贝数改变分析、DNA甲基化水平分析
8）实验室测序与细胞实验
三、结果展示
01 - 利用FLORA工具鉴定GC中的致癌lncRNAs
检查映射到不同基因组区域的读数，发现平均有2.9%的读数被正确映射，并来自可能编码lncRNAs的基因间区域（图S1A，B）。作者开发了FLORA来有效地重建非编码转录组，并优先考虑癌症相关的lncRNAs（图S1C）。
图S1 通过FLORA工具鉴定lncRNA
FLORA从TCGA GC和正常样本中发现了28,507个潜在编码lncRNA的位点。在FLORA报道的所有lncRNA编码基因中，有13675个位点与注释的lncRNA重叠，而10356个位点在GENCODE、Ensembl或RefSeq注释中不存在（图S1D）。最后，保留了4700个平均表达水平超过0.1 FPKM的lncRNA进行下游分析，包括GENCODE中1547个新颖的和3153个已知的lncRNA。与它们配对的正常样本相比，肿瘤中来自已知和潜在lncRNAs的读数分数明显较高，在所有样本中也是如此（图S1E，F）。来自肿瘤和正常组织中编码区域的表达分歧较小（图S1G），表明lncRNAs表现出肿瘤特异性表达模式。
02 - 基于lncRNA的GC亚型的临床相关性
由于lncRNA的表达是高度动态的，对细胞状态的变化很敏感，作者研究了基于lncRNA的分类在分离GC病例中的适用性。基于1235个GC特异性lncRNA，从375个TCGA GC样本中确定了三个稳健的集群：L1（N = 171），L2（N = 104）和L3（N = 100）（图1A，图S2A-C）。359个lncRNAs在L3亚型中特异性富集，而肿瘤抑制因子GUARDIN被下调（图S2D-G）。L3亚型与最差的总生存期相关，而L1亚型的生存结果最好（图1B）。为了验证基于lncRNA的亚型的临床相关性，分析了三个独立队列的微阵列数据。L3亚型在三个独立队列中均表现出较差的总体生存率（图1C和S3A，B）。
图1 基于肿瘤特异性lncRNA表达的分子分类定义了具有预后价值的新型GC亚型
图S2 基于lncRNA表达的GC亚型的鉴定
虽然GC的阶段和诊断时的年龄也与生存期显著相关，但基于lncRNA的亚型与这两个变量无关（图S3C，D）。多变量Cox回归分析显示，L3亚型以及肿瘤期和初诊年龄是GC预后更差的预测因素（图2A）。与单独考虑单个因素相比，肿瘤阶段和基于lncRNA的亚型的组合产生了更大的预测能力（图S3E）。与TCGA数据集的分析一致，L3亚型在独立队列中被确定为独立的预后因素（图S3F-H）。
图S3 不同GC亚型的生存差异比较
03 - lncRNA亚型与组织学之间的联系
单纯根据Lauren分类预测临床结果可能会产生较差的准确性。比较Lauren分类和基于lncRNA的亚型，作者观察到弥散型GC在L2中富集，而肠型在L1和L3中富集（图2B）。肠型GC在生存率上表现出巨大的差异，肠型-L3亚组表现出比肠型-非L3亚组更差的预后（图2C，D）。总的来说，基于lncRNA的L3亚型进一步区分了不同队列中具有不良生存结果的肠道组织学亚组。
图2 基于LncRNA的L3亚型代表了预后不良的肠道GC亚群
04 - 基于lncRNA的GC亚型的基因组和表观遗传学特征
为了描述每个基于lncRNA的亚型的基因组特征，作者整合了TCGA和ACRG队列中GC的突变和CNV谱。在GC最常见的突变中，TP53突变在TCGA和ACRG队列的L3亚型中显著富集（图3A和S5A），而ARID1A、PIK3CA、KMT2B、KRAS和FBXW7突变在L1亚型中更为常见。
此外，在L1亚型中观察到更高的突变负荷，而L3亚型样本的染色体更不稳定，携带的CNV明显多于其他亚型（图3B、C和S5B-E）。与L1和L2亚型相比，L3亚型中19q12(CCNE1)、17q12(ERBB2)、7p11.2(EGFR)和20q13.2(ZNF217)被频繁扩增，而6p25.3(FOXC1)被频繁删除(图S5F-I)。在L3中频繁扩增的癌基因中，CCNE1在L3中表现出明显的高表达水平（图S5J）。
虽然利用这些分子特征进行GC分类，但TCGA研究提出的分子亚型提供的预测能力有限（图S5K，L）。L3主要由CIN肿瘤组成，L2含有较高比例的EBV和GS肿瘤，而L1则富含MSI肿瘤（图3D和S5M）。虽然两者都含有很大一部分CIN亚型GC，但L1-CIN和L3-CIN亚组在患者生存率上表现出巨大差异（图S5N）。
图S5 基于lncRNA亚型的GC患者的基因组改变、拷贝数变异、基因表达和存活率
除基因组改变外，L3亚型还表现出明显的DNA甲基化特征。根据CpG岛甲基化表型(CIMP)的水平，将胃肠道肿瘤分为EBV-CIMP(EBV相关-CIMP)、CIMP-H(高CIMP)、CIMP-L(低CIMP)和非CIMP。非CIMP类在L3亚型中高度富集（图3E）。
图3 基于lncRNA的GC亚型的突变、拷贝数变化和表观遗传学改变的表征
05 - TP53突变和DNA去甲基化的相互作用驱动L3亚型的致癌lncRNA表达和攻击性表型
在L3富集的lncRNA中，137个表现出L3亚型的低甲基化。在L3亚型中表达升高和低甲基化的lncRNA中，H19是GC诊断的分子标志物。基于网络的lncRNA功能预测模块还在其他表征良好的lncRNA上进行了验证，FLORA成功地重建了HOTAIR与HOXA和HOXD基因簇的共表达，HOTTIP与HOXA13、HOXA11和HOXA10的共表达（图S7）。
图S7 致癌lncRNAs的功能预测和实验验证
以GC特异性lncRNA为特征，作者发现了三种基于lncRNA的GC亚型与生存结果有显著关联，并对其组织学和分子特征进行了描述（图S8A）。
06 - 鉴定GC中的致癌lncRNAs
与肿瘤相邻的正常样本相比，在GC中表达显著升高的1235个lncRNA中（图4A），作者发现了几个与更差的生存结果相关的lncRNA，如LINC01614（图4B）。LINC01614被确定为最有希望的lncRNA生物标志物（图S8B），其与GC的相关性在ACRG和新加坡队列中得到了验证（图4D，E）。大多数预后相关的lncRNAs在L3亚型中过度表达。LINC01614在L1亚型和MSI亚型中的表达明显较高（图4A和S8C-F）。
图4 胃癌非编码预后标志物的识别和优先考虑
图S8 LINC01614在不同亚型的GC中的表达
由于发现L1亚型与最佳生存结果相关（图1B，C），分析了LINC01614是否能进一步分离L1亚型，更好地预测患者生存。LINC01614的表达升高也与L1亚型的不良生存相关（图5A，B）。与TCGA队列中LINC01614高表达的L1亚型病例相比，LINC01614高表达的L1亚型病例生存结果更差（图5C-E）。虽然ACRG队列中LINC01614-高L1亚组也富含MSI和弥漫组织学，但LINC01614-高与LINC01614-低L1亚组的转移几率并无显著差异（图S9A-C）。在TCGA和ACRG队列的L1亚型中，LINC01614表达是一个独立的预后因素（图5F，G）。
图5 LINC01614将基于lncRNA的L1亚型分层为不同生存结果的患者群
LINC01614能够稳健地预测生存结果，并有可能导致GC转移。应用功能预测模块，发现有超过100个基因与LINC01614显著相关（图S9D）。此外，在LINC01614的共表达网络中，有很大一部分基因参与了ECM组织（图S9E）。
图S9 基于TCGA数据集中共表达分析的LINC01614高L1肿瘤的特征及功能预测
07 - LINC01614促进GC的实验验证
利用半定量PCR，验证了LINC01614在GC细胞系中高表达，而在正常细胞（GSE1）中低表达（图S10A）。LINC01614在MKN28、MKN1、GES1和MGC803细胞系中的异位表达导致细胞增殖、菌落形成和迁移加速（图6A-D和S10B-M）。此外，在MKN28、MKN1和GES1细胞中进行CRISPR-Cas9敲除LINC01614，在伤口愈合实验中观察到细胞增殖减弱、菌落形成缺陷和迁移明显减少（图6E-H）。
图S10 在GC细胞系中过度表达LINC01614可促进增殖和迁移
图6 LINC01614在胃癌中致癌作用的验证
为了研究LINC01614的下游效应因子，生成了LINC01614 CRISPR-Cas9敲除或过度表达后GC细胞系的RNA-seq数据。LINC01614在GES1和MGC803细胞系中过度表达导致234个基因上调，包括SERPINE1、LAMC2和STC2（图S12A，B）。LINC01614敲除后，MKN1和GES1细胞系中均有227个基因下调，其中158个基因与LINC01614的共表达网络中的基因重叠(图S12C，D)。预先排序的基因集富集分析也发现了与LINC01614操作密切相关的通路（图S12E）。
图S12 LINC01614过表达或CRISPR-Cas9敲除后GC细胞系的全转录组变化分析
四、结论
作者开发了一个新的计算工具FLORA用于lncRNA分析，并提出了一个基于lncRNA的GC亚型系统，可以稳健地分离高危病例。研究全面剖析了这些GC特异性lncRNAs的表达和临床相关性，并发现了包括LINC01614在内的多个预后lncRNAs作为潜在的生物标志物。实验验证了LINC01614的致癌功能，并在多个独立队列中验证了其作为GC预后生物标志物的潜力。
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