回顾过去，流式细胞仪从1参数发展到30参数技术花了50年时间，其中一个重要原因是硬件的复杂性。基本上，12色流式细胞仪就得需要12-14个独立检测器和40多个光学过滤器，目前高端的 30荧光参数 流式细胞仪则需要 32个独立的探测器（加上电源和前置放大器）和大约 50到60多个额外的光学元件。因此复杂性和成本是显而易见的。
1. 全光谱流式
流式Panel设计需要考虑仪器配置、相应荧光染料、靶标蛋白的表达水平和画门分析思路 。一般来说，全光谱流式的Panel设计遵循与传统流式相同的原则，包括画门思路、匹配荧光染料亮度与抗原强度、分析并减少荧光溢出及扩散误差，还有设置多种实验对照。最终数据结果存储为Flow Cytometry Standard (FCS) 格式文件也与传统流式相同。
| 差异比较 | 传统流式细胞仪 | 全光谱流式细胞仪 |
|---|---|---|
| 荧光染料的检测波长范围 | 接近发射波长最大值 | ~350-900 nm |
| 检测器（荧光染料）数量 | 一个 | 多个 |
| 修正荧光溢出方法 | 补偿调节 | 光谱解析 |
| 选择荧光染料 | 考虑光学配置 | 考虑荧光染料的光谱特征是否唯一 |
| 去除自发荧光 | 否 | 是 |
1.1 仪器组件升级
全光谱检测仪器与传统流式分析仪最大的区别在于 光学系统 和 电子系统。传统流式细胞仪采用二色向镜和滤光片组合的方法严重限制了荧光标记数量与染料发射峰值组合的选择。为了提升多色信号采集通道数量，便有厂商将 光通讯技术 应用到流式分析仪中（交叉创新优势明显）。如下图所示，仪器复杂度和光学元件成本在 光谱流式 中大幅度降低。
Purdue大学的光谱技术专利（2011年已经授权索尼）：使用连接到色散元件的32通道PMT阵列，硬件组件减少到几个光学器件和一个探测器阵列
1.2 检测精度升级
在传统流式细胞术中，每种荧光染料都是在单个目标检测通道中进行检测，使用带通或长通滤光片收集发射光谱中的波峰处光谱信息。其他荧光染料会在这个目标检测通道中有发射光的荧光溢漏，这时通过补偿来做调节（如下图A）。相比来说，全光谱流式细胞术是使用多个检测通道来检测的，获得每个激光下荧光染料的全部发射光谱信息，最终得到清晰的荧光光谱特征。重点是最终得到的完整光谱都是有其特征之处（如下图B）。
比较传统和光谱流式的光学检测配置： (A) 在传统流式上，使用单个检测通道来收集单个荧光染料的发射光信息，仅收集一部分发射光；通过补偿调节荧光溢漏误差。(B) 在光谱流式上，使用多个检测通道来收集所有荧光染料的全部发射光谱信息；通过解析区分不同荧光染料
传统流式使用补偿来调节荧光溢出，而全光谱流式通过光谱解析来区别出每个荧光染料。光谱解析是通过数学算法，根据荧光染料的独特光谱特征，区分出多色样本中的单色荧光。光谱流式正是通过这种方法，优势1：区分出波峰相近、完整光谱不同的荧光染料，最终在一个Panel中使用（例如 cytek 凭借三个激光器就可以做到26色），而这在传统流式中不能实现。优势2：光谱流式还可以从荧光信号中摘取细胞的自发荧光，提高数据结果准确性（免除阴性对照管，节省样本细胞）。
市场现状：
- 索尼：2012年发布全球第一款全光谱细胞分析仪；2015年，索尼发布SA3800全自动光谱细胞分析仪；2019年推出旗舰级全光谱流式细胞分析仪ID7000
- Cytek：2017年推出了拥有独创专利技术的旗舰级产品Aurora系列全光谱流式细胞仪
- 赛默飞：2021年发布全光谱流式细胞分选仪—Bigfoot
- BD：2022年6月，率先将光谱流式细胞术与可分选成像相结合，推出新品BD FACSDiscover™ S8 细胞分选仪
举例SONY ID7000：样本在流动池被鞘液约束成单个细胞流，顺序被激光器照射后，直接用光缆将接收到的信号传递过来，通过光栅分散到每根滤光片上检测，和传统流式仪相比缺少了各种各样的滤光片的分光，转而通过最后众多微透镜检测414-845nm所有波段的荧光强度
不同激光器激发细胞得到的荧光，经过光缆传递给光栅将不同波长的光分开，每一个波段的光有对应的一段微透镜过滤接收，右下图显示的是一个细胞在4根激光器激发后不同波段的荧光强度，右上图展示所有细胞综合得到的一个效果图（彩虹图），每一条段的横线代表一个细胞，纵坐标越高表示荧光强度越强，暖色越深表示细胞越集中
2. 质谱流式
质谱流式细胞术是指用稳定的重金属同位素（主要是镧系元素）代替荧光基团来标记抗体。然后将细胞引入CyTOF分析仪并雾化成液滴，液滴被汽化、雾化、电离，然后通过电势加速被带入质谱仪。最后，用TOF探测器对过滤后的离子云进行分析。
质谱流式的优势：
- 检测通道间无串色：单通道的峰宽比荧光光谱窄
- 无自发荧光的干扰
- 检测通道数量多（理论上 135个）
- 方案设计更容易
质谱流式的劣势：
- 与传统的流式细胞仪相比，分析速度更慢
- 由于细胞被气化，所以没法进行FSC和SSC测量（也没办法回收细胞）
- 样品制备必须比传统流式更干净，因为在获取时所有生物材料都会气化，如果不干净可能导致碳积聚并降低灵敏度
- 商业标记抗体数量有限（不过目前越来越多厂家加入，使得这些目录逐渐在完善）
- 数据结构复杂，需要新的数据分析工具和方法
荧光流式与质谱流式的对比：质谱流式整个流程与荧光流式相似，通过抗原与抗体结合的方式进行细胞的功能表达定量分析
汇总当下几种相似功能的技术方法的差异如下表格：
| 差异比较 | 全光谱流式 | 质谱流式 | CITE-seq |
|---|---|---|---|
| 细胞标记 | 荧光素标记 | 重金属标记 | DNA barcode |
| 检测方法 | 荧光强度 | 重金属含量 | DNA测序 |
| 检测参数 | up to 30 | up to 50 | 82 |
| 灵敏度 | high (光信号放大) | a bit lower | high(PCR 信号放大) |
| 可行性 | 简单 | 中等 | 复杂 |
| 检测维度 | 蛋白 | 蛋白 | 蛋白 & mRNA |
| 细胞通量 | 10,000 cells/second | 300 cells/second | 30,000 cells/experiment |
| 实验花费 | 低 | 高 | 高 |
胡言乱语：目前质谱流式主要是在科研市场，虽然临床和制药领域已经开展了不少临床试验，但是还没有真正进入临床市场，还没有任何一家公司获得任何国家的医疗器械注册证。
临床市场更关注 操作简便、灵敏度高、检测耗时短、单次样本测试成本低 的特点，质谱流式与全光谱流式比较的话在以上几点便逊色了很多，而其优势的 多参数检测 并不是临床亟待解决的需求。同时，光谱流式与常规流式在方法学一致，可直接拿来就用（客户已被传统流式教育过），过渡性好，短期内而言具有更优的商业价值。
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