全书总结

这本药品微生物检验检测实用指南就学习完了

从开始的了解自然界的微生物，到人工培养，分离纯化，鉴别，以及把它作为对照判断结果，这也是整个的实验流程

那我们就从实验步骤开始讲起，做实验之前你需要对于我们使用的菌种熟悉，会用染色法鉴别，然后是环境，器具，仪器设备的验证和校准，是否处于正常状态中，按照规定操作后是否处于无菌，避免给结果造成影响

我们在准备开展微生物实验室时需要先规划一下实验室的位置，应该与化验室房间分隔开，比如在走廊的两头，里面房间的布局也是按照功能用途来划分，如清洗间，操作间，缓冲间，灭菌消毒间，培养间，保藏间等，然后是划分ABCD洁净度等级，根据受污染风险度高低的方法来划分，最容易受污染的是操作间，因为需要打开袋子取样或接种，所以操作间为A或B级，无菌检查需要在A级操作间，非无菌检查在B级操作间，缓冲间和一更，二更为C级区域，因为我们需要进去换操作服和手套，除了这些房间，其它的为D级区域，以什么为标准来判断洁净度级别是否合格？空气中的悬浮粒子数量和大小。在微生物室内需要安装独立的空调和排风系统，空调负责输送经过过滤的无菌空气，排风则把空气经过过滤排出大气中，整个风系统都是单向流，从洁净度高的区域流向洁净度低的区域

接下来是使用方法，不同的药品需要用不同的方法，非无菌检查法用的平板计数法，控制菌检查法和薄膜过滤法，有抑菌作用的药品需要用薄膜过滤法

平板计数法做的是需氧菌菌落总数和霉菌酵母菌菌落总数测定，一般以菌落总数单位CFU计数，如果连成片的菌种不宜计数

弄清楚了检验方法，接下来是配制培养基和样品，培养基配制可以按照药典规定下的处方制备，也可以购买干粉培养基

按照处方制备的培养基大多需要蛋白胨，葡萄糖（单糖，双糖，多糖都可以），金属离子（生长因子），无机盐类，琼脂（凝固剂）

有些特殊培养基需要加抑菌剂和指示剂

实验室购买的是干粉培养基，在制备时加蒸馏水或去离子水就可以了，放在高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌锅需要有一定的装载量，让蒸汽可以流通，灭菌开始前要关闭排水阀，放气阀在开始升温时先打开，让锅内的冷空气先排出来，然后到100摄氏度时才把阀门关闭让压力升高，灭菌完后需要等压力降到0才打开放气阀取出物品，培养基不能长期放在灭菌锅中，灭完后要及时拿出来，因为在高温的环境下会让培养基的性质发生改变，会造成浑浊，沉淀等现象

干粉培养基的干燥方法

1:真空干燥法，物料在真空的环境中被加热，由于环境是真空，物料中的水很容易就达到沸点变成蒸汽后被收集排出去

2:喷雾干燥法，把物料放在喷雾机中喷成细小的颗粒物，再通入热蒸汽，热蒸汽与颗粒物接触后可以快速带走它表面的水分（表面的水分遇热变成水蒸气），颗粒物除去水分后就变成干粉落下接收槽后被送出

3:烘干法，把各组分配制好后放在干燥箱内烘干水分

4:研磨法，先把各组分分别烘干，然后加到研磨机中研磨均匀

拿出来的培养基冷却至室温后以无菌操作取出一小块测量pH，无特殊规定下不得超过正负0.2

如果是琼脂培养基需要分装，得等到45摄氏度以下再倒平皿，倒后的平皿需要放在培养箱中烘干表面的水蒸气，因为细菌在培养时会长出鞭毛造成泳动，使菌落连成一片影响计数

灭菌方法有几种，环氧乙烷灭菌法，可以杀灭所有的细菌和芽孢，是药品中常用的灭菌方法，缺点是对人体有害

干热灭菌法和湿热灭菌法，干热灭菌法主要是在干燥箱内灭菌，160摄氏度2小时

一般采用的都是湿热灭菌，100摄氏度加热一小时～两小时可以杀死所有的细菌芽孢，什么是细菌芽孢？细菌在恶劣环境中身体的一种自我保护机制，用于抵抗环境不适，等环境恢复后机体就会从休眠状态中恢复，继续繁殖生长

湿热灭菌方法有几种？流通蒸汽灭菌法和沸水灭菌法，流通蒸汽灭菌分为间歇式的流通蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌

间歇式的流通蒸汽灭菌和沸水灭菌法都是适合成分不耐高温的培养基，沸水灭菌法在短时间内只能杀死细菌，间歇式的流通蒸汽灭菌法可以杀灭所有的细菌和芽孢，具体操作是先通入75～90摄氏度的蒸汽30～60分钟，然后再把灭菌物品放在37摄氏度的培养箱中孵化，第二天再用流通蒸汽灭菌30～60分钟，再次放在培养箱中孵化，就这样灭菌三次，可以杀灭所有的细菌和芽孢，因为放在培养箱中孵化可以让芽孢繁殖成细菌体后再用流通蒸汽杀灭，这样孵化后杀灭就可以消灭所有的芽孢

还有一种是高压蒸汽灭菌，温度可以达到121摄氏度，灭菌15分钟就可以杀灭所有芽孢和细菌繁殖体

湿热灭菌比干热灭菌法常用，因为湿热灭菌穿透性强，可以更快的摧毁细菌中的蛋白质结构

接下来是供试液的制备，供试液的制备有以下几种方法

1:乳化法，适合非水溶性的物质

2:研磨法，固体供试品，仪器是均质仪

3:萃取法，脂溶性的物质，取水溶性那层作为供试液

4:灭活剂法：具有抑菌作用的药品，加入灭活剂可以中和药品中的抑菌性

液体的供试液怎么制备？固体和半固体的供试液，首先先用稀释液制备成1:10的供试液， 稀释液一般是蛋白胨缓冲液或者无菌生理盐水，样品首先要溶于稀试液中，溶于水的药品一般可以溶于稀试液中，如果是不溶于水的样品呢，首先有两种方法，用乳化法或萃取法，什么是乳化法呢，就是利用乳化剂的表面活性物质把亲水和疏水性的基团暴露出来，使不溶于水的物质和水相连，萃取是根据物质在不同溶剂中的溶解度不同来提取分离

供试液制备好了，接下来是菌液的制备

菌液的制备需要菌种，从保藏中心购买的冻干粉为0代，复苏传代到三代才可以使用，菌种传代的方法是，先从底部往上划直线，然后再画曲线，这样划线的好处使菌种均匀的分散在培养基上，充分的利用营养。菌种传代后需要用平板计数法分离，分离方法有：连续划线法，平板涂布法，分段划线法。通过不同的划线方式可以分离出单个菌落，挑取可疑菌落染色放在显微镜下观察，确认是目标菌株后，再挑取可疑单个菌种与甘油混合后放在-30～-80摄氏度下保存，一般菌种的活力可以维持一年，期间需要定期进行菌种复活，分离纯化鉴定再保存

菌液制备方法，一种是稀释法，一种是比浊管对比法，稀释法就是按照不同的稀释倍数稀释到自己想要的菌落总数，而比浊管对比法是制备成菌悬液和标准比浊管进行对比，确定菌悬液的浓度再进行稀释。如果制备的菌液透明度较低，可以离心后取上清液

然后是做实验，非无菌检查分为控制菌检查和微生物计数法两种，控制菌检查一般需要把菌种先制备成菌悬液，然后加入到相应的液体培养基中增殖分化，后取出少量划线接种在琼脂平板上

计数法是吸取一定量的样液加入到灭菌平皿中，后倒入琼脂混匀计数

最后是菌种的销毁处理，需要有专门销毁处理流程和相应的记录