肿瘤内异质性（Intra-tumor heterogeneity, ITH）是导致抗癌疗法失败和患者死亡的关键因素之一，也是研究人员力图解决的重要课题。深入研究ITH，有助于了解肿瘤的发生机制、演化规律及解释治疗过程中耐药性等产生的原因。2021年4月7日，以弗朗西斯·克里克研究所为首的研究团队在Cell发表了ITH研究工作，该研究对38种癌症类型的2,658个癌症样品的全基因组数据进行深入探究，全面揭示了不同癌症类型的ITH特征。
一、研究背景
ITH一直是癌症治疗的难题，因为它提供了可能驱动癌症进展并导致耐药性出现的遗传变异。ITH越高，越容易产生耐药性。然而，ITH在不同癌症类型中的程度、起源和驱动因素却知之甚少。以前的泛癌研究依赖于外显子组测序，限制了体细胞突变的检测和亚克隆的分离。最近的研究多依赖于全基因组、外显子组或靶向捕获测序来探究特定癌症类型中的ITH。单样本分析可能会低估ITH，因为在一个区域发现的克隆变异在另一个区域可能是亚克隆（“克隆性错觉”）。该研究开发了一个强大的共识策略，通过检测拷贝数和簇突变来评估ITH及其起源、驱动因素在肿瘤发生和发展中的作用。并将这些方法应用于38种不同的癌症类型的2,658个肿瘤数据进行研究。结果强调了ITH及其驱动因素在肿瘤进化中的重要性，并从全基因组测序数据中提供了一个全面注释亚克隆事件的泛癌资源。
二、材料方法
该研究基于ICGC-TCGA全基因组泛癌分析（PCAWG）项目（简称泛癌项目）的2,658个癌症样本的全基因组测序数据进行研究。PCAWG研究是一项国际合作项目，旨在确定ICGC的2600多个癌症全基因组的常见突变模式。其全基因组测序采用Illumina HiSeq测序平台，每个肿瘤样本的最小覆盖率为30X。该研究通过突变等位基因的局部拷贝数和样品纯度来估计癌细胞分数（Cancer cell fraction，CCF），随后基于突变的CCF进行聚类，得出样品的“亚克隆结构”，从而估计不同肿瘤亚克隆的数量、其CCF和相应突变的数目，进而对不同癌症中的ITH特征及其起源、变化模式进行深入探讨。
三、研究结果
1、2,658例癌症中ITH的共识特征
研究人员利用PCAWG数据集来表征不同癌症类型的ITH，包括单核苷酸变异（Single-nucleotide variants，SNVs）、插入或缺失变异（Insertions or deletions，Indels）、结构变异（Structural variations，SVs）和拷贝数变异（Copy number alterations，CNAs）以及亚克隆驱动因素、亚克隆选择和突变特征等。为最大限度地提高克隆和亚克隆突变的检测敏感性和特异性，研究人员开发了用于变异检测、拷贝数检测和亚克隆重建的集成方法。基于集成策略，研究人员获得了每个肿瘤样本的亚克隆的数量、亚克隆SNVs、Indels、SVs和CNAs的比例，以及SNVs、Indels和SVs在亚克隆中的分配情况。
图1 ITH表征的共识策略（图片引自原文1）
2、不同癌症类型中ITH普遍存在
基于共识策略，研究人员评估了亚克隆在肿瘤间扩增的证据。结果发现1,621（95.1％）个肿瘤中检测到一个或多个亚克隆扩增。在所有癌症类型中除黑色素瘤之外，超过75％的样本显示至少一种亚克隆扩增的证据。该研究说明ITH在不同癌症类型中普遍存在。此外，研究还发现亚克隆SNVs、Indels、SVs和CNAs的平均比例在不同癌症类型之间差异很大，如鳞状细胞癌亚克隆SNVs比例较低，而肾嫌色细胞癌，胰腺神经内分泌肿瘤和毛细胞星形细胞瘤亚克隆SNVs的比例最高。不同癌症类型中亚克隆变异的比例差异表明每种癌症类型都有其独特的进化历程。
图2 不同癌症类型ITH的概况和特征（图片引自原文1）
3、全基因组测序揭示亚克隆间复杂的系统发育
两个亚克隆之间可能线性相关（类似“父子关系”），或者是并行分支（类似“兄弟关系”）。研究人员利用PCAWG数据集推测出了亚克隆之间的关系，并利用其阶段化结果来评估亚克隆重建的性能。研究发现，在泛癌环境中，两个亚克隆之间为分支关系的可能性是线性关系的3.11倍。且分支关系与线性关系的比率与突变率无关，即使在那些突变率较低的肿瘤中也是如此，说明分支进化是不同类型肿瘤的常态。
图3 不同癌症类型亚克隆关系及ITH进一步表征（图片引自原文1）
4、不同癌症类型亚克隆突变特征的变化模式
突变在癌细胞中的积累是外部原因（如吸烟、暴露在紫外线下）或内部原因（如复制错误、DNA损伤修复失败）造成的。不同因素的造成的突变，其DNA突变有一定的特征。研究人员评估了不同突变特征的动态变化。研究发现，1,944个样本（76%）的一个或多个突变特征变化超过6%，平均每个样本有1.77个突变特征的改变。总体而言，克隆和亚克隆之间的突变特征非常稳定。对不同癌症类型的突变特征变化轨迹研究发现突变特征的变化反应了癌症的进展历程，且突变特征的变化和克隆/亚克隆的CCF变化点相吻合。该结果表明亚克隆扩增通常与突变特征的变化相关，结果强调了突变可能会造成亚克隆的扩增。
图4 不同癌症类型的突变特征变化情况及其变化轨迹（图片引自原文1）
5、不同癌症类型的驱动突变和亚克隆选择
研究人员利用PCAWG驱动注释方法深入了解了克隆驱动突变和亚克隆驱动突变（SNVs、Indels和SVs）之间的关系，结果发现85%的至少有一个亚克隆的样本中不包含已鉴定的亚克隆驱动SNV或Indel，只有11%的亚克隆包含已鉴定的驱动SNV或Indel，相比之下，76%的样本检测到已鉴定的克隆驱动SNV或Indel。DN/DS分析发现大多数癌症类型的亚克隆驱动突变倾向于阳性选择而不是中性进化形成了亚克隆的扩增。最后，为探究ITH对临床治疗的潜在影响，研究人员评估了活性驱动突变的克隆性，结果发现60.1%的肿瘤至少有一个临床活性位点，其中9.7%包含至少一个亚克隆活性驱动因子，4.7%仅显示亚克隆活性位点，这可能是临床上靶向亚克隆突变治疗失败的原因。该结果强调了评估突变克隆性的临床重要性。
图5 不同癌症类型的驱动突变和亚克隆选择（图片引自原文1）
四、总结
该研究建立在PCAWG计划的大量癌症全基因组数据的基础上，可以从单个癌症样本中详细描述ITH。研究表明几乎所有的癌症样本（95.1%）都发生了明显的亚克隆扩增，ITH在不同癌症中普遍存在，并表现为癌症类型特定的模式。肿瘤亚克隆表现出丰富的线性和分枝进化模式，且亚克隆突变过程是动态变化的。该研究结果证实并强调了ITH及其驱动因素在肿瘤发生发展中的重要性，为进一步深入了解肿瘤突变过程及肿瘤进化动力学提供了详细的见解。
参考文献：
1.Dentro SC, Leshchiner I, HaaseK, et al. PCAWG Evolution and Heterogeneity Working Group and the PCAWG Consortium. Characterizing genetic intra-tumor heterogeneity across 2,658 human cancer genomes[J]. Cell, 2021, 184(8):2239-2254.
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