T细胞的发育

T 细胞的胸腺发育是一个高度复杂和严格控制的过程，从来自骨髓的早期祖细胞开始，它既不表达 CD4也不表达 CD8表面标记，称为双阴性(dN)胸腺细胞，并以成熟的单阳性(SP) CD4和 CD8胸腺细胞结束。在 DN 区室内，通过 CD44和 CD25标记物的差异表达来标记四个连续阶段: DN1(CD25-CD44hi) ，DN2(CD25 + CD44 +) ，DN3(CD25 + CD44 -)和 DN4(CD25-CD44 -)。属于主要 αβT 细胞谱系的细胞进一步发展至双阳性 CD4 + CD8 + (DP)阶段，其中 αβ 肿瘤细胞受容体(TCR)复合物首先在细胞表面表达，允许胸腺内肽/MHC 配体参与(图5.1 a)。在这个阶段，具有高自我亲和力的细胞经历凋亡死亡(阴性选择) ，而具有较低自我亲和力的细胞经历活化，并进一步分化为单个阳性 T 细胞(阳性选择)。这些过程非常严格，导致90% 以上的 DP 胸腺细胞细胞程序性死亡。这些选择过程中的缺陷可能导致强烈自我反应性 T 细胞的存活以及随之而来的自家免疫性疾病。被选择存活的少数胸腺细胞经历 SP CD4或 CD8谱系的交替承诺[1-7]。不管最终的谱系承诺是什么，DP 细胞最初下调 CD8共受体，产生中间的 CD4 + CD8lo 细胞8-9。从这个常见的 CD4 + 8 lo 阶段开始，细胞可以通过额外的中间阶段(CD4loCD8lo 和 CD4loCD8 +)直接成熟为 SP CD4细胞或 SP CD8细胞[9-10]。对 CD8或 CD4谱系的承诺与显影胸腺细胞对 MHC I 类或 II 类的特异性之间存在近乎完美的相关性。谱系选择与 MHC 类别特异性的正确匹配对于正确的 T 细胞功能非常重要。MHC 特异性和功能谱系选择之间的这种近乎完美的相关性是如何实现的，目前尚不完全清楚。

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T淋巴细胞发育。 (a) 胸腺发育阶段的简化图，依次包括双阴性 (DN)、双阳性 (DP)、中间 CD4+8lo，最后是单阳性 (SP) CD4 和 CD8。 TCR 和 CD69 表面标志物表达的变化也标志着胸腺发育。随着胸腺细胞从 DP 成熟到 CD4+8lo 阶段，甚至在随后过渡到 SP CD4 和 CD8 阶段，TCR 和 CD69 表面标志物都被上调。最后，就在离开胸腺之前，SP 胸腺细胞失去 CD69 表达，但仍保持高 TCR 表达。在 CD4+8lo 阶段，MHC II 类和 I 类特异性细胞分别表达高水平或低水平的 ThPOK，并分化为交替的 CD4 和 CD8 谱系。 (b) 如图所示，总胸腺细胞或 MHC I 类或 II 类特异性胸腺细胞的 CD4、CD8、CD69 和 TCR 的表面表达模式示意图。

那么CD4和CD8为何会分开的呢？

在二十世纪九十年代后期，Kappes 等人鉴定了由于自发突变而缺乏 CD4 + 辅助细胞的自发突变小鼠系(辅助细胞缺陷或辅助细胞缺陷) ，这是鉴定 ThPOK 作为 CD4谱系选择的主要调节的第一步[29-30](图5.2 a)。随后将自发突变小鼠回交至 MHC I 类缺陷背景的小鼠，发现自发突变中缺乏 CD4 T 细胞并非由于阻断了 MHC II 类限制性胸腺细胞的发育，而是由于它们重新定向至 CD8。这一发现导致的结论是，谱系选择和阳性选择是两个机制上不同的过程[30]。最后，在2005年，该突变被定位为编码转录因子 ThPOK (T helper-inducing POZ Krueppel factor) 的基因的点突变——导致其去氧核糖核酸结合结构域中的单个氨基酸置换(R to G)31。来自另一组的这些和后来的研究确定，ThPOK 作为谱系继承的“主要调节因子”，其存在或不存在对于驱动未成熟胸腺细胞分别向 CD4或 CD8谱系的发育是必要的和足够的[32-33]。ThPOK 基因的结构和表达模式似乎在其他脊椎动物谱系的多骨鱼类分化之前就已经保守了(图5.3)。

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ThPOK 基因的表达模式在 T 细胞发育过程中受到严格调控。在早期 DN 和预选 DP 阶段，ThPOK mRNA 基本上检测不到。ThPOK mRNA 首先在 CD4 + CD8lo 胸腺细胞中检测到。重要的是，在 II 类中，ThPOK mRNA 比 I 类限制性 CD4 + 8 lo 细胞高得多，表明这些细胞中的 ThPOK 基因座对 MHC I 类或 II 类限制性 TCR 信号有差异反应。ThPOK mRNA 水平随后在发育到 SP CD4阶段期间进一步增加，而在发育到 SP CD8阶段期间降低到背景水平。与信号强度和动力学模型管线内，TCR 信号的强度和持续时间是决定第一类与第二类限制性 CD4 + CD8lo 胸腺细胞中 ThPOK 基因的阶段特异性差异活化的主要因素。因此，即使在 I 类限制性 CD4 + CD8lo T 细胞中，TCR 信号传导的强制活化也诱导了 ThPOK mRNA 的表达[34]。活体内。值得注意的是，ThPOK 基因座对 TCR 信号传导的敏感性是阶段性的。活体内和活体外的 TCR 活化不能在 DP 或任何 DP 前期胸腺细胞中诱导 ThPOK 表达，但只能在 CD4 + 8 lo 细胞中诱导 ThPOK 表达。有证据表明，在未成熟的胸腺细胞中，ThPOK 基因座对 TCR 信号传导的不可及性可能受到表观遗传学调控。因此，在 DP 胸腺细胞中，ThPOK 基因座通过激活(H3K4me3)和抑制(H3K27me3)标记来标记，与表观遗传“平衡”状态一致。因此，在从 DP 到 SP 的转变过程中，各种转录和外遗传的机制可能协同调节 ThPOK 的基因表达。

鉴于 ThPOK 作为 CD4 谱系定型的主要调节因子并主要在转录水平受到调节，阐明其转录调节的分子机制变得至关重要。当作为转基因引入 HD 小鼠时，围绕 ThPOK 基因座并以 CTCF 绝缘体为界的 20kb 区域足以重建正常的谱系定型[36]。对该区域的进一步研究确定了6个 DNase 超敏反应(dHS)位点，包括2个启动子和4个其他推定的顺式调节元件[36] ，这些位点对于在造血过程中 ThPOK 表达的阶段特异性调节似乎是必要和充分的。在六个 dHS 位点中， silencer element at DHS site A (SilThPOK) 比较特殊，因为其来自 ThPOK-GFP 报道基因的缺失消除了谱系特异性调节，导致 CD4和 CD8T 细胞中的混杂表达。此外，缺乏 (SilThPOK) 的敲除小鼠在 I 类限制性胸腺细胞中表现出 ThPOK 的完全除抑制，由于 I 类限制性胸腺细胞重定向至 CD4谱系，导致 CD8 T 细胞数量严重减少[36]。有有趣的是，在成熟 CD8 T 细胞中条件性删除(SilThPOK) 并不会抑制 ThPOK 表达，这表明 CD8 谱系定型需要基因座的永久表观遗传沉默 [34]。总的来说，这些结果表明 (SilThPOK) 功能部分受阶段和谱系特异性染色质修饰和 DNA 结合蛋白的顺序募集控制。[34]。总的来说，这些结果表明，(SilThPOK) 功能部分受到阶段和谱系特异性核组蛋白修饰以及去氧核糖核酸结合蛋白序列募集的控制。控制 (SilThPOK) 功能的精确转录因素仍然没有完全表征。一个重要的因素是 Runx3，它之前已经被证明对 CD8分化是必不可少的[35,36]。SilThPOK 区域有两个假定的 Runx 结合位点，这些基序的缺失会损害消声器的活性。有趣的是，染色质免疫沉淀(chIP)分析显示 Runx 复合物在胸腺 T 细胞发育的所有阶段都与 SilthPOK 结合，表明 Runx 结合不足以解释 SilthPOK 的阶段特异性调节。因此，差异 TCR 信号特异性调节 SilThPOK 活性的分子基础尚未建立。

5.10. Runx 和 ThPOK 对 CD4/CD8 谱系发育的相反影响

有几条证据支持 ThPOK 作为 CD4 谱系规范的主要转录调节因子和 Runx3 的拮抗剂。 ThPOK 与 CD4 谱系规范中涉及的多个基因的调节有关，包括 CD4 和 ThPOK，至少在某些情况下通过直接结合到靶基因座。 ThPOK 与 CD4 和 ThPOK 消音器的直接结合会拮抗它们的功能并启动支持 CD4 表面表达和增加 ThPOK 本身转录的正反馈循环。 DN 和 CD4+CD8lo 胸腺细胞中 ThPOK 的诱导表达介导 CD4 表达的去抑制，并且在外周 CD8 T 细胞中导致包括 GATA-3 在内的几种 CD4 谱系限制基因的激活 [37-38]。此外，由于许多 CD8 特异性基因（包括 CD8、Perforin、Granzyme B 和 Eomes）的下调，异位 ThPOK 表达导致外周 CD8 T 细胞出现严重的功能缺陷 [39]。 ThPOK 也被证明可以与其自身的消音器结合并拮抗其功能，这表明存在正反馈调节回路 [38]。另一方面，成熟 CD4 T 细胞中 ThPOK 表达减少，导致包括 CD4 在内的 CD4 谱系特异性基因下调，Runx3 和 Eomes 等细胞毒性谱系基因上调，获得高 IFN-γ 生产能力和转分化为 CD8 T细胞转移到 T 细胞缺陷小鼠中 [38]。体外共转染试验表明，ThPOK 拮抗 Runx 介导的由 CD4 沉默子控制的报告基因的抑制 [37-39]。此外，ThPOK 在 II 类限制性细胞的分化过程中抑制 Runx3 远端启动子活性，尽管尚不清楚这种影响是否是直接的 [40-42]。有趣的是，组蛋白去乙酰化酶抑制剂 TsA 可以有效地消除 ThPOK 对 Runx 介导的沉默的拮抗作用，这表明拮抗作用取决于 ThPOK 对与 Runx 结合作用的未知因子的转录抑制，这是一种阻遏物模型。 [43]。总之，目前的数据表明，ThPOK 和 Runx3 分别通过支持 CD4 和 CD8 谱系特异性基因表达程序来拮抗彼此的功能。由 ThPOK 发起的调控循环部分解释了在 CD4+CD8lo 阶段诱导 ThPOK 有限表达的初始谱系规范信号如何被放大以驱动完整的 CD4 承诺