肾透明细胞癌（ccRCC）是肾细胞癌中最常见也最具侵袭性的癌症亚型，容易术后复发和转移，预后较差。目前，ccRCC的治疗方法主要包括常规化疗、靶向治疗和免疫治疗，但疗效受到肿瘤异质性的影响。因此，有必要了解ccRCC的细胞和分子机制，以促进biomarker的发现和指导临床干预。
本文中，研究者利用单细胞测序技术，结合多组学联合分析思路，绘制了ccRCC原发肿瘤组织的转录和表观基因组图谱，揭示了肿瘤特异的调控信号和免疫细胞功能相关的多个转录因子（TFs），为剖析ccRCC的异质性及鉴定潜在治疗靶点提供了重要见解。
文章详情
文章题目：Single-cell multiomics analysis reveals regulatory programs in clear cell renal cell carcinoma
中文题目：单细胞多组学分析揭示肾透明细胞癌的调控程序
发表时间：2022.07
期刊名称：Cell Discovery
影响因子：38.079
实验平台：10x Chromium 单细胞转录组测序+单细胞ATAC测序
DOI：10.1038/s41421-022-00415-0
研究内容
⏩ 单细胞水平分析ccRCC中的转录组和染色质可及性
为了探究ccRCC肿瘤的异质性，研究者对三名患者进行了单细胞转录组+单细胞ATAC测序，并额外对一名患者进行单细胞转录组测序（所有患者均携带VHL基因的突变）。经过质量控制筛选，共获得38097个细胞的转录组和21272个细胞的染色质可及性信息，并基于marker基因注释到15种细胞类型。对于单细胞ATAC测序结果，基于marker基因启动子区域的可及性进行细胞注释，并将结果与单细胞转录组结果比较和联合分析，最终注释到12种细胞类型。这12种细胞类型包括5种淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞、内皮细胞（VCAM+和VCAM-）、系膜细胞和肿瘤细胞（基于marker基因和infer CNV分析结果注释得到）。在ccRCC整个肿瘤微环境（TME）中，免疫细胞占比最高，肿瘤细胞不到10%，且细胞丰度在不同患者内有所不同。综上所述，将单细胞转录组和单细胞ATAC测序结果整合分析揭示了ccRCC中细胞组成的异质性。
Fig.1 人ccRCC单细胞水平的转录和染色质可及性图谱
⏩ ccRCC中的肿瘤特异性调控元件
对单细胞染色质可及性进行差异分析发现共有22682个独特的peak在不同细胞类型具有显著差异，并将其命名为DARs。大多数 DARs 位于基因组的启动子和内含子区域，并且其分布在不同细胞类型中相对保守。此外，研究者发现肿瘤细胞的DARs和差异表达基因（DEGs）主要富集在代谢相关的生物学过程中。接下来，研究者利用算法筛选出在肿瘤细胞中富集的高特异性TFs，并鉴定出49个TFs在肿瘤细胞里的活性高于其他细胞类型。利用TCGA数据库中的ccRCC（TCGA-KIRC）队列数据分析这些肿瘤特异性TFs与患者预后的关系，发现肿瘤特异性TFs高表达的患者的总生存率和无病生存率更差。接下来，研究者从中挑选出四个表达水平与较差的总生存率显著相关的TFs（HOXC5、VENTX、ISL1和OTP，它们的结合位点位于ATAC测序得到的染色质可及区域里）进行分析，发现它们调控多种肿瘤特异性基因，致使其在肿瘤中的表达水平显著上升。而敲除这些TFs基因可显著降低肿瘤细胞增殖并增加细胞死亡。为了寻找针对这些TFs的候选药物，研究者使用了LINCS consortium找到了2个候选药物能显著降低HOXC5、VENTX和ISL1的表达水平，同时显著降低了肿瘤细胞的增殖率。
Fig.2 鉴定肿瘤特异性调控元件
Fig.3 四种肿瘤特异性TFs的特性研究
⏩ ccRCC内的恶性转录程序
研究者从四个样品中选出3564个肿瘤细胞来分析ccRCC中基因表达模式在不同恶性细胞中是如何变化的，并发现在这些肿瘤细胞中持续存在多种不同的转录状态。利用NMF法来定义了11个肿瘤内转录程序，进一步聚类分层确定了2个元程序，它们包含了四个样品中高度相似的程序。利用通路富集分析来确认这2个元程序的生物学功能发现元程序1的基因显著富集于应激相关途径，而元程序2基因主要参与代谢相关的生物过程。再次结合TCGA-KIRC队列数据检验预后相关性发现元程序1高表达的患者总存活率较差，而元程序2高表达的患者总存活率较好。分析上文中鉴定到的四个肿瘤特异性TFs和这2个元程序的调控关系，发现元程序1中的VEGFA和元程序2的CRYAB都受到这四个TFs的调控。
Fig.4 解析ccRCC内的恶性转录程序
⏩ ccRCC中CD8+T细胞聚类分析
CD8+T淋巴细胞在抑制肿瘤发展中起关键作用。为了阐明肿瘤浸润性CD8+T细胞的异质性，研究者从单细胞转录组数据中鉴定到4个CD8+T细胞亚群，单细胞ATAC测序数据中鉴定到5个CD8+T细胞亚群。其中，耗竭亚群的细胞毒性、耗竭性和终末分化特性最强。组织驻留C1亚群的耗竭性祖细胞特征分数最高，而终末耗竭特征分数最低，说明这个亚群在肿瘤免疫治疗中可能有重要作用。两个组织驻留亚群中的C1与炎症反应显著相关，而C2富集细胞因子和微生素代谢途径。在TCGA-KIRC队列和CheckMate-025（抗PD-1治疗的随机III期试验）队列发现耗竭亚群中DEGs的平均表达水平与较差的总体生存率相关。与CD8+T细胞耗竭有关的调控元件：EOMES 和BATF，高度富集于耗竭亚群中，多个Rel/NF-κB 家族的 TFs也富集在耗竭亚群中。有趣的是，两个耗竭即刻早期基因（IEG）细胞亚群受到不同TFs的调控。
Fig.5 ccRCC内CD8+T细胞的特征⏩ccRCC中巨噬细胞聚类分析
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是肿瘤中主要的髓细胞群，在肿瘤发生和耐药性中起重要作用。为了阐明TAM的异质性，研究者从单细胞转录组数据中鉴定到3个TAM细胞亚群，单细胞ATAC测序数据中鉴定到3个TAM细胞亚群。在单细胞转录组得到的分群中，TAM-RGCC亚群的M1特征分数最高，其次是TAM-C1QB亚群，而TAM-LGALS3的M2特征分数最高。TAM-RGCC亚群具有较高的血管生成特征分数，而TAM-C1QB亚群具有最高的吞噬作用特征分数。此外，研究者确认了免疫检查点基因和共刺激分子的表达情况。影响T细胞免疫检查点的配体基因在TAM-C1QB亚群高度表达，而LGALS9在TAM-LGALS3特异性表达。研究者还发现三个TAM亚群具有不同的TF调控程序，其中有四个TFs的基因活性和表达水平在对应的亚群中均大幅增加。其中MEF2C在促进M1巨噬细胞极化和诱导巨噬细胞死亡方面起到重要作用，该TF的靶基因包括多个TFs和趋化因子，这些靶基因已被证明与巨噬细胞的吞噬和血管生成作用相关。在TCGA-KIRC和CheckMate-025两个队列中，这些靶基因的特征分数与更好的存活率有关。
Fig.6 ccRCC内TAMs的特征
⏩ccRCC微环境中的细胞通讯
使用CellPhone DB分析ccRCC微环境中的细胞通讯，研究者发现内皮细胞具有最多的配体受体互作关系对，而B细胞最少。肿瘤细胞是整个TME中关键的细胞类型，它们与其他细胞的互作关系在肿瘤发生过程中起重要作用。在本研究中，肿瘤细胞主要与内皮细胞、TAMs、增殖性CD8+T细胞和耗竭T细胞相互作用。巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）及其配体互作是肿瘤细胞和TAM三个细胞亚群之间较强的相互作用。研究者还发现了在ccRCC中尚未报道的新互作关系，如RPS19和C5AR1（在乳腺癌和卵巢癌TME中起到免疫抑制作用）。在TCGA-KIRC队列中，这两个基因平均表达水平高的患者预后差。在肿瘤细胞与三种淋巴细胞亚群的互作关系中，研究者鉴定到Treg—肿瘤细胞特异性互作关系：LTB-LTBR，这是纤维肉瘤和肝细胞癌形成的必要因素。这两个基因平均表达水平高也与较差的预后相关。
Fig.7 肿瘤和免疫细胞间的配体受体互作关系
结果总结
本研究利用单细胞转录组和单细胞ATAC测序技术绘制了ccRCC的转录和表观基因组图谱，确定了四个介导肿瘤细胞特异性调控程序的关键TFs（HOXC5、VENTX、ISL1和OTP），它们具有预后意义。接下来，研究者联合分析了CD8+T细胞和巨噬细胞亚群的染色质可及性和基因表达模式，发现了这些细胞亚群中不同的调控元件。此外，研究者还描述了TME中配体-受体相互作用所介导的细胞间通讯。综上所述，这种单细胞多组学方法进一步阐明了ccRCC的细胞异质性，并确定潜在的治疗靶点。
网友评论