MERFISH超高分辨成像技术

关于超高分辨显微成像技术，庄小威教授在Science杂志上了发表综述文章全面总结了该领域的发展，BioArt邀请专家的特别解读文章：专家解读丨庄小威组在Science总结超分辨显微成像技术。
今天我们来看下这篇特别详细的解读，为了能够更好的理解这篇解读，我们在正式看之前先来看一下昨天提过的STORM技术原理。因为MERFISH超高分辨成像技术是在STORM技术上的进阶。理解它的工作原理可以让我们好的理解MERFISH技术。

STORM（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy），其实正确的中文翻译为“随机光学重构显微技术”

STORM的关键是在于突破了如何用光控开关探针，来实现单分子发光与重组成像的技术。

2004年，她的研究组就发现了某种花青染料具有光控开关的性质。庄小威利用这种光控开关性质，让原本很挤的生物分子们分别单独发光。照完一张相后，让本来的发光点“关灯”，让原本不发光的点“开灯”，再继续照相。

STORM成像原理图
注：光控开关性质：染料可通过不同颜色的激光，使自身激活成荧光状态和失活无光状态，通俗点说就是和“开灯”和“关灯”一样道理。

如此反复，拍下成千上万张显微像后再重新叠加，最后得到超高分辨率的图像。这种方法巧妙地“克服了光的衍射极限”，得到了高于普通光学显微镜10倍的超高分辨率。在2011年，她又进一步克服了之前耗时长的缺点，开发出了更高性能的STORM。

STORM与传统显微镜的分辨率对比
神经元轴突中肌动蛋白，常规图像（上）和3D STORM图像的比较（2013年）

有了简单的铺垫，我们来看下BioArt里的对MERFISH超高分辨成像技术的解读
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人类基因组中包含2万多个基因以及上百万个调控元件。在过去近20年的后基因组时代中比如“ENCODE计划”鉴定出了大量的DNA和组蛋白的表观修饰，蛋白-DNA相互作用，DNA-DNA相互作用，甚至非编码RNA-DNA相互作用来简析基因组是如何被调节和控制。进一步在不同的组织和细胞中筛选分类，以便于人们更好地理解基因是如何在不同的细胞中特异表达，并在细胞分化、胚胎发育和人类疾病等过程中发挥重要作用。

人类基因组含有约30亿个DNA碱基对，细胞核内的DNA大约2米长，而细胞核的大小一般在10-20微米左右。染色体在3D水平的高度折叠以及动态变化被认为对基因表达和调控具有重要影响。然后真正带我们进入三维基因组学（3Dgenome）的研究得益于以高通量的测序以及Hi-C等相关技术的开发，NIH还因此在2014年启动了4D核体计划（4D Nucleome，图0）。Hi-C利用测序和生物信息方法来分析整个基因组的DNA-DNA之间俩俩相互作用，用以建立基因组三维折叠模型。目前可以达到1kb或更高的分辨率，越来越多的基因组高级结构的特征被发现，例如拓扑相关结构域（topologically associating domains ,TADs）和染色质环（loops）等。这些研究都是基于群体细胞平均（population average）的分析，目前的scHi-C（single cell Hi-C）方法还不能在单细胞水平看到清晰的TAD结构。所以TAD是否在细胞核内是一个物理学的结构（physical structure）一直存在争议。

图0. 4D核体计划（The 4D Nucleome Project. Nature 2017, 549: 219-226.）
用超高分辨显微成像单细胞TAD结构可以和Hi-C完美的互补，很好地去证明这个问题。最近哈佛大学庄小威实验室和博后Alistair Boettiger（现任职于斯坦福大学的助理教授）共同在Science杂志发表了题为Super-ResolutionChromatin Tracing Reveals Domains and Cooperative Interactions in Single Cells的研究论文，揭示单细胞染色质超分辨显微结构。
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庄小威实验室早期开发了MERFISH（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization）用于高通量的原位识别细胞内成千上万种RNA分子，后来又将该技术应用于原位成像基因组DNA。但要使用MERFISH进行超高分辨显微（STORM）成像TADs结构需要进一步挺高特异性和灵敏度。这篇论文通过二级杂交使得MERFISH成为可以进行在超分辨率下示踪染色质结构的方法（图1）。

图1. 超分辨率染色质示踪方法示意图
他们将目标基因组区域（比如1.2 Mb）划分为41个片段，每个片段长度为30 kb，每次荧光原位杂交成像单个片段，然后洗脱或漂泊，连续跟踪41轮直到成像完成整个区域。这使得能够以许多伪彩色生成染色质区域的3D超分辨率图像，每个伪彩色都以几十纳米的精度报告每一30kb片段的位置和结构（图2）。
图2. 3D STORM超高分辨成像21号染色体1.2 Mb的区域
第一个核心问题是如何把成像的数据和Hi-C的数据相比较（图3）。
图3. 3D STORM超高分辨成像21号染色体1.2 Mb的区域
Hi-C是通过大量的DNA-DNA片段（例如30 kb的分辨率）的俩俩相互作用来绘制热图。这篇论文中MERFISH成像的结果则通过不同DNA片段之间的重叠程度（spatial-overlap）和片段之间的中心距离（spatial-distance）来绘制热图。结果发现通过群体细胞绘制的热图和Hi-C的热图非常相似。

但不同的是单细胞Hi-C看不到清晰的TAD结构，而超高分辨成像可以看到每个细胞中清晰的类TAD（TAD-like）结构。TAD边界（boundaries）在每个细胞中也非常清晰，在染色体的结构蛋白CTCF和黏连蛋白（cohesin）的结合位点有富集效应，但细胞与细胞之间的差异非常大，而且在整个区域的任何地方都可能成为边界（图4）。

图4. 超高分辨成像单细胞TAD-like结构
TAD被认为是通过cohesin介导的DNA环外挤（loop extrusion）来形成【7】。Hi-C的实验结果也证实了如果快速降解cohesin可以消除TAD结构，但染色体活性和不激活的隔室（A/B compartment）结构仍然存在【8】。成像的结果和Hi-C非常相似，当cohesin被快速去除之后，群体细胞分析显示TADs和sub-TADs结构消失。但不同的是，单细胞中的类TAD结构依然存在（图5），细胞与细胞之间差异也仍然存在。但确定TAD边界（boundaries）不再有CTCF和cohesin结合位置的特异性，而是均匀分布在整个区域。
图5. 超高分辨成像Cohesin去除之后染色体区域的结构
Hi-C通过分析DNA片段之间俩俩相互作用来建立基因组3D结构模型，但群体细胞分析中观察到的多位点（a,b, c, d....）相互作用并不能代表单细胞的行为，而单细胞Hi-C中又不能清晰地看到多位点之间的相互作用。超分辨率染色质示踪的方法很好地通过空间和距离的分析解决了这一难题。文章中发现两个含有CTCF位点的片段重叠往往也会和第三个含有CTCF位点的片段重叠，以此类推，多个邻近的CTCF位点可能都会聚集在一起（图6）。其它非CTCF位点也有类似的情况，而且这些聚集并不受cohesin去除的影响。
图6. 超高分辨成像三个有CTCF位点片段之间的相互作用
MERFISH超高分辨成像技术可以在纳米尺度，千碱基分辨率下解析几千个细胞的3D基因组结构。利用这个方法直接证明了类TAD结构域是在细胞里真实存在的物理性结构（physicalstructure）。但同时也发现类TAD结构以及其边界（boundaries）在单细胞中的高度异质性，这也许说明TAD结构在活细胞状态下有可能是高度动态的。和Hi-C结构有明显不同的是单细胞中类TAD结构一直存在，即使去除了染色体结构蛋白cohesin也不受影响。这和我们以前认为TAD结构在细胞内的存在形式有很大的差别，因此单细胞中类TADs结构域的形成（formation）、保持（maintenance）和动态变化（dynamics）机制将有待进一步深入研究。

论文中发现基因组30 kb DNA片段之间往往多位点相互作用暗示着染色体可能通过形成很多不同的集散地（hubs）来发挥功能。那么这些集散地形成，保持和动态变化也同样值得深入研究。进一步提高这项超技术的灵敏度到10kb、5 kb 甚至1kb将有机会看到TADs和sub-TADs里面的基因结构和变化。同时还可以和蛋白染色、RNA标记以及活细胞跟踪等技术相结合，阐述基因在胚胎发育、细胞命运决定和疾病发生过程中精确的时空调节以及分子机理。