衰老的特点是分子、细胞和器官损伤的逐渐积累，导致生物功能下降，对疾病和死亡的敏感性增加。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为首个实现完整基因组测序的模式真核细胞，具有繁殖迅速、培养条件简单、基因组小等优点，并且与人类的衰老曲线相似，成为衰老寿命研究的理想模型。基于酵母模型的衰老研究揭示了多种保守的寿命调控通路，并可以揭示衰老与mRNA出核之间的有趣关系。THO复合体是一个保守的多亚基组装体，包括Hpr1、Tho2、Mft1、Thp2和Tex1，与其他因子（如TREX和TREX-2）错综复杂地连接，这些因子对mRNA出核至关重要。Nrd1与衰老之间的直接相关性尚未确定，但Nrd1、Rrp6和RNA监测通路之间的复杂相互作用可能与细胞衰老过程密切相关。总之，衰老与RNA生物发生和出核之间的关系越来越引起人们的兴趣，但其确切机制尚不清楚。
2024年5月20日，韩国汉阳大学Soo Young Cho/Hong-Yeoul Ryu/Seong Hoon Ahn合作研究发现，THO复合体的Hpr1和Tho2两个组分缺失会导致复制寿命（replicative lifespan，RLS）减少，且与一种新的不依赖于Sir2的RLS调控通路相关。相关成果以“Tho2-mediated escort of Nrd1 regulates the expression of aging-related genes”为题发表在《Aging Cell》（IF 7.8 / 1区）期刊上。
标题：Tho2-mediated escort of Nrd1 regulates the expression of aging-related genes（Tho2介导Nrd1调控衰老相关基因表达）
时间：2024-5-20
期刊：Aging Cell
影响因子：IF 7.8 / Q1
技术平台：ChIP-seq、RNA-seq等
研究摘要：
THO复合体对于mRNA共转录成熟和出核至关重要。尽管核糖体组分Rrp6对hpr1Δ或tho2Δ突变体中的转录本螯合产生抗性，但这种螯合缺失未能减轻hpr1Δ中的RLS缺失。hpr1Δ或tho2Δ中的RLS缺失被与Rrp6互作的Nrd1特异性突变体的额外表达所抵消。这种作用依赖于Nrd1与RNA聚合酶II互作，Nrd1是衰老相关基因的转录调节因子，包括核糖体生物发生或RNA代谢基因。Nrd1过表达降低了Tho2依赖性通路中的RLS。而Tho2缺失通过诱导Nrd1在染色质上的任意结合来响应Nrd1过表达效应。全基因组ChIP-seq分析揭示在Tho2缺失后，Nrd1对与衰老相关的翻译相关基因招募增加。本研究结果强调了Tho2介导的Nrd1通过衰老相关基因转录调控在寿命通路调控中的重要性。这项研究提供了对衰老分子机制的新见解，特别是关于RNA代谢和转录调控如何与衰老过程互作的理解，对Tho2-Nrd1轴的进一步研究可能有助于开发延缓衰老和改善健康寿命的策略。
实验方法：
本研究使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae作为模型生物，通过基因敲除和过表达等方法，结合斑点实验、RLS分析、CLS分析、ChIP-seq和RNA-seq等技术手段进行研究。
结果图形：
（1）THO复合体以不依赖于Sir2方式调控RLS
图1：THO复合体中的Hpr1和Tho2以Sir2非依赖性方式影响RLS。
（a、b）WT和指示突变体的RLS分析。平均寿命显示在括号中。
（2）Hpr1不依赖于核酸外切酶成分Rrp6影响寿命
图2：RRP6缺失可以挽救Rho诱导的细胞中受损的RLS，但不能挽救hpr1Δ细胞。
（a） 用空载体（pCM189）或表达Rho的质粒（pCM189-Ro）转化的WT和rrp6∆菌株进行RLS分析，如图1所示。为了进行生长分析，将所示菌株的十倍稀释液点样在Rho抑制（+Doxy）或Rho诱导（−Doxy）板上，然后在25°C下生长2-3天。
（b） 两种不同遗传背景（BY4741和W303α）中WT和指示突变菌株的RLS分析，如图1所示。
（c） WT和指示突变体的CLS分析。括号中的两个数字表示中位寿命和最长寿命，根据培养物分别达到50%和10%活性天数计算。
（3）Nrd1突变恢复rho诱导的RLS缩短
图3：Nrd1突变体中Rho表达可以恢复缩短的复制性寿命（RLS）。
(a) Nrd1温敏突变体nrd1-51(S16P)和nrd1-102(V379G)的示意图。Nrd1结构域包括RNA聚合酶II
CTD互作域(CID)、Nab3互作域(Nab3)、精氨酸-谷氨酰胺和精氨酸-丝氨酸富含区域(RE/RS)、RNA识别结构域(RRM)以及脯氨酸和谷氨酰胺富含区域(P/Q)。
(b) 在YPD培养基板上对nrd1-51和nrd1-102菌株在25、30和37°C下进行生长分析，如图2a所述。
(c-e) 对野生型(WT)和指示突变体进行RLS分析，这些突变体被转化空载体（c）、pCM189或pCM189-Rho（d,
e），如图1所述。
（4）Nrd1的不同截短变体能够缓解tho2Δ细胞中的寿命缺陷。
图4：Nrd1蛋白截短体过表达显著恢复了tho2Δ细胞中受损的复制性寿命（RLS）。
(a) Nrd1点突变体和截短体示意图。
(b、c、f) 如图1所述，对野生型（WT）和指定突变体进行RLS分析。
(d) 如图1所述，对WT或tho2Δ菌株转化空载体（pAG425GPD）或表达指定Nrd1截短变体的质粒后进行RLS分析。
(e、h) 如图1所述，对nrd1Δ或tho2Δ
nrd1Δ菌株转化表达NRD1或nrd1ΔCID的质粒后进行RLS分析。(g) 如图2a所述，在25、30和37°C下对(f)中使用的菌株在YPD平板上进行生长分析。
（5）Nrd1通过Tho2依赖性通路调控寿命
图5：Nrd1过表达以Tho2依赖性方式损害RLS。
(a) PMA1、PYK1和ADH1基因示意图。TATA/启动子（Pro）和ORF分别由黑色和白色框表示。基因下方的条形图显示用于ChIP-qPCR分析的PCR产物的相对位置。
(b) 在表达TAP标记的Nrd1菌株中使用IgG-琼脂糖珠进行ChIP分析。BY4741（无标签）菌株用作阴性对照。所指示基因的qPCR信号被定量并标准化到内部背景对照和input DNA。使用的引物对在(a)中指示。
(c) 对WT和tho2Δ菌株转化pAG425GPD或pAG425GPD-NRD1（NRD1-OE）进行RLS分析，如图1所述。
(d) WT和tho2Δ菌株中Nrd1-TAP的ChIP-seq数据。饼图显示Nrd1峰在WT（左图）和tho2Δ（右图）菌株中的启动子、外显子、下游和远端间隔区的分布。括号中的数字表示检测到的位点数量。
(e) 在(d)中的Nrd1峰的维恩图。
(f) 对WT中Nrd1富集基因的GO富集分析点图。
(g) 在(d)中的ChIP-seq数据的聚类热图。通过K-means聚类，将转录起始位点（TSS）和转录结束位点（TES）处显著富集的Nrd1结合峰分为三个聚类。括号中的数字表示检测到的Nrd1峰数量。
(h) 在(g)中的ChIP
reads密度分布。剖面图显示了每个聚类的平均ChIP信号。
(i) 在(g)中基因的GO富集分析。条形图表示每个聚类的GO生物过程的倍数富集。
(j) 综合基因组学浏览器（IGV）截图显示tho2Δ增加（红色）或减少（蓝色）Nrd1招募的水平。从WT中的IP/INPUT峰值比率中减去tho2Δ中的峰值比率，以说明在指定基因中观察到的变化。
（6）与翻译和核转运相关的基因在tho2Δ和衰老细胞中均下调
图6：在酵母细胞中，Tho2蛋白缺失与衰老细胞之间mRNA表达谱比较。
(a) 火山图显示tho2Δ菌株与野生型（WT）相比差异表达的基因。
(b) 对先前的RNA-seq实验（Hendrickson等人，2018年）中的衰老细胞基因进行GO富集分析，并在(a)中展示。通过过滤数据（p值≤0.05和|倍数变化|>1），获取了衰老细胞与年轻细胞相比差异表达的基因列表。条形图表示在上调（红色）或下调（蓝色）基因中前11个GO生物过程术语的富集倍数。
(c) Nrd1 ChIP读取密度分布，显示了与WT相比，tho2Δ菌株中差异表达的基因。对于上调和下调基因的分析（分别是上图和下图），通过过滤数据（p值≤0.05和|倍数变化|>2），分别获取了145个和182个基因。
(d) 对(c)中上调（红色）或下调（蓝色）基因的GO分析，如(a)中所述。
(e) IGV（综合基因组学浏览器）截图，显示了tho2Δ改变了Nrd1的招募水平，如图5J所述。
(f–h) 对衰老细胞（Hendrickson等人，2018年）中差异表达基因的Nrd1结合峰进行聚类分析，这些基因在WT和tho2Δ菌株中的Nrd1占据情况。热图(f)、密度剖面图(g)和GO分析(h)是K-means聚类比对 reads位置结果。
(i) Tho2在调控复制性寿命（RLS）中作用的示意图。tho2缺失未能防止Nrd1的过度招募，导致与翻译相关的基因表达下降，进而导致RLS减少。
（7）参与翻译和RNA加工的基因亚群是Tho2和Nrd1的靶标
图7：衰老细胞中Nrd1结合基因与差异表达基因的比较分析。
（a） 在衰老细胞中，Nrd1结合基因与上调（红色）或下调（蓝色）基因重叠的GO分析，如图6b所示。条形图显示了在ORF或3′UTR中结合位点的Nrd1结合基因的前七个GO生物过程的倍数富集。如果Nrd1在这些区域有结合位点，那么这些基因在衰老细胞中的表达变化可能与Nrd1结合有关。
（b） （a）中显示的Nrd1结合基因的维恩图。中间的表格显示了Nrd1在ORF和3′-UTR或仅在3′-UTR结合的代表性基因，以及它们与相邻基因的长度和距离。
图8：tho2Δ细胞中Nrd1结合基因与差异表达基因的比较。
（a）
Nrd1结合基因表达由tho2Δ上调（红色）或下调（蓝色）的前八到九个GO分析，如图7a所示。这些基因在tho2Δ细胞中的表达水平与野生型细胞相比有显著变化，并且这些变化的基因与Nrd1的结合位点有关。
（b） （a）中显示的Nrd1结合基因的Venn图分析，如图7b所示。确定哪些基因仅在tho2Δ细胞中上调或下调，哪些基因同时在tho2Δ和其他条件下也有差异表达，以及哪些基因不受tho2Δ影响。
参考文献：
Liu Y, Park JM, LimS, Duan R, Lee DY, Choi D, Choi DK, Rhie BH, Cho SY, Ryu HY, Ahn SH.Tho2-mediated escort of Nrd1 regulates the expression of aging-related genes.Aging Cell. 2024 May 20:e14203. doi: 10.1111/acel.14203. PubMed PMID: 38769776.
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