视频链接：https://www.youtube.com/watch?v=rOm6UIPhHnc&list=PLjiXAZO27elC_xnk7gVNM85I2IQl5BEJN&index=2
大纲：
1. 背景
基因转录不是连续平稳且波动较小的过程，而是表现出发生时间极不规律、信使RNA产量波动极大的特征。转录爆发本质上是编码和传递调控信号的方式。
因此同一种细胞在不同时间的mRNA和蛋白水平存在很大差异。
除了转录爆发以外，drop out效应（细胞中实际有某基因的表达但是检测结果为零表达，一般由单细胞平台对mRNA的捕获效率也就是敏感性和转录效率等决定）和扩增偏倚也会对结果产生影响。
2. 可能存在问题的步骤
单细胞测序的pipeline：
可能存在问题的步骤：
1. 细胞解离
在单细胞测序中，得到健康的单细胞是非常重要的。不完全的解离可以引起多细胞粘连，而过去粗暴的解离则会损伤细胞，引起RNA降解和泄漏。（泄漏的mRNA-背景信号）
值得注意的是，细胞解离过程可能会引起细胞的转录改变，从而影响结果。
此外，如上图，3天的样本中所有细胞都检测到了中性粒细胞的marker，有可能不当解离引起中性粒细胞大量破坏，释放mRNA到周围环境所致。
2. 细胞捕获
不同的平台都存在空液滴、双细胞或者多细胞存在。捕获细胞数越多，双细胞/多细胞率越高。
⚠️在降维图上，双细胞常常可以独自聚成一群或者呈现为细胞群和群之间的条纹状连接。（因为和正常细胞表达谱有差异但也有相似性）
目前有很多软件可以用来检测并排除单细胞样本中的双细胞
这些双细胞去除的软件原理都是类似的，见：DoubletFinder。需要注意的是，软件预测的双细胞不一定是双细胞，在去除的时候需要谨慎。
⚠️：像DoubletFinder这类双细胞去除软件对细胞异质性较大的组织效果较好。但像一些比如说90%都是T细胞的样本，双细胞去除软件的效果可能不是那么好。
3. 裂解细胞（以制备文库）
不同的细胞裂解条件不一致，细胞膜和核膜的裂解条件也不一致。不当的细胞裂解可能会引起RNA的damage，从而影响建库过程。根据细胞和样本类型选择是否溶解核膜，核膜的裂解与否也会对最后的转录landscape产生很大影响。
4. 逆转录过程（big limiting step）
逆转录过程中单细胞平台对mRNA的捕获效率（敏感性）也会对结果产生影响。（drop out效应）
5. 预扩增过程
6. 文库制备和测序过程
3. Spike-in RNAs
Spike-in指的是：RNA的spike-in是一组序列已知的RNA转录本，目前普遍使用的是ERCC(The External RNA Control Consortium)。也可以使用序列相似度较低的物种如酵母S.pombe和S.cerevisiae的序列作为spike-in。通过在样品制备过程中混入指定数量的spike-in，我们就可以知道不同样本中的基因绝对比表达值。如等细胞数的样本A和样本B，在每个样本中，我加入了等量的spike-in。最后分析发现，spike-in占样本A的1%，但是占样本B的5%。这表明样本A的RNA表达量也许普遍比样本B的表达量高五倍左右。
但值得注意的是，在10x技术中，是不使用Spike-in的。因为大多数的液滴实际上是空液滴，如果在其中都加入Spike-in，那么测到的大多是都是含有Spike-in的空液滴。
4. 质量控制
质控的标准和方法多样
5. 如何过滤细胞
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