影响因子：9.0
研究概述：皮肤黑色素瘤死亡率高，尽管免疫检查点抑制剂（ICI）在其治疗中已取得重大进展，但仍有相当一部分黑色素瘤患者对基于ICI的疗法反应不积极，而大量证据表明黑色素瘤的异质性是治疗失败的主要原因。最近，肿瘤焦亡被认为是一种很有前景的治疗策略，焦亡是一种程序性细胞死亡，与炎症反应以及肿瘤微环境中的免疫调节高度相关。然而，目前对于焦亡在癌症中的研究结论不一致，部分结果甚至完全相反，但先前的研究均是在mRNA的水平，这不足以评估肿瘤异质性与焦亡之间的关联，因此本文的目标是评估黑色素瘤显著的异质性。在这项研究中，作者进行了bulk和单细胞转录组联合分析，确定免疫细胞群和免疫基因模块后进行了一系列体外细胞实验，以进一步探索不同免疫细胞中焦亡相关基因的特定表达机制，并利用免疫组化和多重免疫荧光染色实验验证了关键基因的表达失调。
****对于想发高分文章且有实验条件的朋友，干湿结合是省时省经费的最佳选择！需要做类似的生信分析欢迎交流！****
研究结果：
黑色素瘤组织的表皮层中 PRGs 阳性细胞较少
作者先从GSEA数据库获得焦亡相关基因（PRGs），基于TCGA黑色素瘤患者的bulk转录组数据以及生存信息进行生存分析并绘制KM曲线，从而确定了五个生存相关的PRGs：GZMA, GSDMB, IL18, CHMP4A和NLRP1（图A）。同时，利用MCODE算法以及CytoNCA算法，作者对从GSEA数据库获得的PRGs进行蛋白-蛋白互作（PPI）分析，发现生存分析鉴定出的五个基因处于PPI网络的核心位置（图B）。接着作者用样本进行了ELISA实验与免疫组化，发现这五个蛋白在黑色素瘤患者的表达量都较正常皮肤组织低，提示这五个PRGs可能是黑色素瘤保护因素（图C,D）。随后，作者进一步探索了表皮组织中五个基因的表达情况并得到了一致的结果（图E）。虽然这五个PRGs在mRNA水平支持其参与调控黑色素瘤发生发展的可能，但并不能解释细胞来源异质性的主要科学问题，因此需要单细胞转录组进一步分析。
对黑色素瘤免疫微环境进行单细胞转录组分析
单细胞转录组数据来自GSE108394, GSE215120和GSE180885，共有126987位患者，作者将正常组织和黑色素瘤组织分开进行分析。首先使用seraut包进行tSNE降维聚类，共鉴定出25个细胞亚群，又进一步根据各细胞群的标记基因将其归类为免疫细胞、肿瘤细胞以及基质细胞（内皮细胞，成纤维细胞）（图A,B）。图C是确定细胞类型所用的10个标记基因在黑色素瘤细胞群中的表达情况，这10个基因来自前人的工作，包括黑色素瘤细胞 (MLANA, PMEL), T细胞 (CD3D, CD3E)，B细胞 (CD79A), 髓系细胞 (CD68), 成纤维细胞 (PDGFRB, COL1A1), 和内皮细胞 (CDH5, ENG)。图D比例柱状图展示了正常组织和黑色素瘤组织显著不同的细胞组成。图E展示了5个PRGs在各个细胞簇的表达情况，发现这五种 PRGs 主要在免疫细胞中表达，尤其是在 T 细胞相关亚群中。
黑色素瘤的免疫微环境
为进一步探索黑色素瘤的免疫微环境，作者对免疫细胞亚群（T细胞，B细胞，NK细胞，髓系细胞，基质细胞）进行了进一步分析。图A是tSNE降维聚类，图B是不同细胞群的marker基因。接下来作者使用Monocle包对免疫细胞进行拟时序分析以探索其发育轨迹（图C），结果表明亚群0,1,2主要位于发育树的根部，说明来自CD8+T细胞和NK细胞亚群的细胞分化程度可能较低，提示其发挥抗肿瘤免疫的潜能更大。接下来，基于bulk转录组，作者使用CIBERSORT算法评估了每个患者的免疫细胞浸润水平，并将免疫细胞类型作为表型进行WGCNA分析（图D），蓝色模块排名第一（图E），这说明该模块的基因与关注的免疫细胞浸润水平密切相关，且该模块与CD8+T细胞和NK细胞的关联最强。因此，作者对临床表皮样本进行了免疫组化（图F,G），关注CD8+T细胞的标志CD8以及NK细胞的标志CD57，发现表皮区域肿瘤细胞的CD8和CD57明显少于正常细胞。
主要在免疫细胞中表达的 PRGs
第二张图E发现5个基因主要在T细胞相关的亚组中表达，进一步基于免疫细胞的tSNE降维，作者发现PRGs主要在CD8+T细胞以及NK细胞中表达（图A）。具体来说，GSDMB在NK细胞（群2）中高表达，其次是CD8+ T细胞（群1），CHMP4A在不同的免疫亚群中没有差异表达，而NLRP1的表达较少，在实验验证方面，为深入了解免疫浸润的程度，作者通过免疫组化以及ELISA发现PRGs的表达差异在淋巴细胞聚集区域最多，尤其是GZMA+细胞，GSDMB+细胞和CHMP4A+细胞（图B,C），这说明PRGs可能主要在免疫细胞中表达，这需要通过免疫荧光共定位进一步证实。
GZMA 和 GSDMB 由 CD8+ T 细胞和 NK 细胞分泌
使用多重免疫荧光染色，作者用DAPI将细胞核标记为蓝色，用CD8和CD57将CD8+T细胞和NK细胞标记为紫色，将GZMA标记为绿色，将GSDMB标记为红色，证实了黑色素瘤CD8+T细胞和NK细胞中GZMA和GSDMB表达的下调（图A）。TissueFAXS技术表明（图B）：对照样本中 CD8 和 GZMA 的共表达率高达4.02%，而黑色素瘤样本中CD8+ T细胞中 GZMA的表达率仅为 0.11%；与对照样本（1.09%）相比，GSDMB+细胞在肿瘤 CD8+ 细胞中的共表达频率同样较低（0.78%），这与NK细胞的结果一致。这部分结果证实并验证了单细胞转录组的发现，即GZMA+细胞和GSDMB+细胞是由CD8 + T细胞和NK细胞分泌的。
临床相关性和焦亡预后诺莫图
经过单细胞转录组以及实验验证，最终确定GZMA 和 GSDMB可能是黑色素治疗的新靶点，这部分结合临床信息验证其预测预后的效能。图A是GZMA和GSDMB以及其他临床常用指标的单因素cox回归结果，图B是多因素cox回归结果，发现GZMA是独立危险因素而GSDMB只在单因素cox回归中具有显著性。随后基于GZMA和GSDMB的表达构建了风险得分，发现此得分可以预测患者生存（图C,D）。为了全面考量危险因素，作者构建了基于PRGs和临床特征的预后诺莫图，发现估计值与实际观测值之间的比较显示出较强的预测效能。
研究总结： 这篇文章基于bulk和单细胞转录组对黑色素瘤的PRGs表达谱进行了全面评估，发现PRGs在免疫细胞中显著失调，并使用实验验证了肿瘤 CD8+细胞和 CD57+细胞中GZMA和GSDMB的下调，最终结合临床数据证明GZMA和GSDMB可作为保护性预后预测因子。
网友评论