自身免疫疾病（autoimmune diseases）是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害的疾病，是由机体组织的免疫耐受特性被破坏和（或）免疫系统的免疫平衡功能发生紊乱所造成的。当由各种原因导致T/B淋巴细胞不能正确识别异己抗原时，它们就可能会“攻击”我们机体的各个组织器官，造成它们的变性、损伤及其本有的正常功能减退、异常乃至丧失。当今世界约有5%-8%的人正遭受自身免疫性疾病的折磨，经历巨大的痛苦。自身免疫病病因复杂，主要包括遗传因素、感染诱发、性别因素、年龄因素以及环境因素。由于发病机制多样性，使其一般难以治愈，治疗只能延缓病情进展。
自身免疫性疾病的单细胞测序通过分析免疫细胞的基因表达状态，发现新的细胞类型，揭示免疫细胞发育谱系，鉴定免疫反应的调控程序，可以从单细胞水平更深层次的阐明自身免疫疾病的发病机制，进一步探寻新的治疗策略，使更多患者从中获益。本期推送所带来的两项研究采用单细胞测序技术深入研究系统性红斑狼疮和I型糖尿病背后的发病机制。
自身免疫性疾病研究的难点是什么？
自身免疫性疾病有100多种，系统性红斑狼疮、多发性硬化症、克罗恩病、I型糖尿病、银屑病、肾小球肾炎、强直性脊柱炎、甲状腺功能亢进等都是自身免疫病或有自身免疫因素在其中。尽管自身免疫性疾病种类繁多，但许多都有相似的外在症状——疲劳、关节痛、皮肤问题。这使得临床诊断变得困难，并且需要采用通常只能缓解症状的广泛治疗方法。即使研究人员在开发靶向疗法方面取得了一定进展，依旧存在诸多可能导致治疗失败的未知因素：
“近年来，自身免疫性疾病的治疗受益于针对特定免疫细胞和炎症介质的治疗能力。然而，迄今为止取得的临床进展是有限的。例如，尽管减少[类风湿性关节炎]疾病活动的可用生物疗法的数量有所增加，但许多患者对所有当前疗法的反应都很差，并且许多最初对药物有反应的患者随着时间的推移反应减弱，原因不明……此外，对于最严重的[系统性红斑狼疮]，包括影响中枢神经系统或肾脏的那些自身免疫性疾病，没有有效的治疗方法”[1]。
显然，我们需要对自身免疫性疾病的发病机制和治疗反应的潜在生物学有更深入的了解。越来越多的科学家转向高分辨率单细胞测序技术，以深入表征驱动自身免疫反应的特殊细胞的复杂网络。由于能够更详细地定义不同的细胞类型和状态，并解开驱动疾病进展和严重程度的分子机制，免疫学家可以为未来更具体的诊断和治疗选择奠定基础。
单细胞技术探究系统性红斑狼疮的细胞起源
单细胞方法有潜力解锁常见自身免疫疾病的隐藏生物特征，使我们对那些困扰了几代人，但治疗进展依旧甚微的复杂疾病有更深入的理解。Djamel Nehar-Belaid博士团队在2020年的Nature Immunology上发表了题为“Mapping systemiclupus erythematosus heterogeneity at the single-cell level”的研究论文，研究了儿科患者系统性红斑狼疮 (SLE) 的细胞起源。
SLE是最常见的狼疮形式，通常表现为疲劳、皮疹、发烧以及关节疼痛或肿胀。然而，不同的临床表现阻碍了临床试验的重大进展，60多年来，只有一种新的治疗方法被批准用于SLE[2]。此外，尽管被认为与环境、遗传和荷尔蒙因素有关，但其原因仍然基本未知[3]。
单细胞RNA测序使我们对疾病异质性和潜在治疗的理解更加深入。在这项研究中，与健康对照相比，研究人员能够确定SLE儿童的特定细胞特征。这涉及干扰素刺激基因 (ISG) 的表达增加，这些基因源自主要外周免疫细胞类型中转录定义的亚群，包括单核细胞、CD4+ 和CD8+ T细胞、自然杀伤细胞、树突细胞、B细胞和浆细胞。
研究人员还能够根据富含ISG和其他狼疮相关基因的细胞亚群的扩展来区分疾病活动度最高的患者[2]。该发现建立了一个细胞框架来对患者进行分层，并指出许多特定的细胞靶点以进行进一步的治疗探索。
单细胞技术探究基因突变如何加速I型糖尿病的发病
I型糖尿病 (T1D) 是一种慢性自身免疫性疾病，会导致胰腺无法制造胰岛素[4]。其发病的关键可能在于我们的基因。I型糖尿病通常出现在儿童、青少年和年轻人中，他们大多数人应该是健康的，因此科学家们一直在寻找赋予T1D风险的遗传因素。随着研究的深入，这一切指向了STAT3--一种已知可调节与细胞存活、增殖、激活和分化相关的基因的转录因子。在胰腺细胞内，STAT3还支持胰岛发育和胰岛素分泌[5]。
许多全基因组关联研究都指出STAT3是与T1D相关的易感等位基因，2014年的一项针对早发型自身免疫性疾病(包括I型糖尿病)患者的研究再次指出，生殖系激活STAT3突变可能是罪魁祸首[6]。但是由于无法了解STAT3功能获得 (GOF) 导致的糖尿病发病机制中的细胞类型，科学家们无法解决突变以外的导致疾病发病的机制。
在此基础上，Jeremy Warshauser博士及其团队试图确定STAT3-GOF突变导致糖尿病发病的细胞基础。他们于2021年在Journal of Experimental Medicine上发表了一篇题为“Ahuman mutation in STAT3 promotes type I diabetes through a defect in CD8+ Tcell tolerance”的研究论文，该研究建立了一个人类STAT3突变的敲入小鼠模型，观察到小鼠模仿自身免疫性糖尿病的表型。
结合单细胞转录组测序分析、单细胞免疫组库分析和染色质可及性分析，研究人员深入描述了胰岛内的免疫图谱，确定了糖尿病小鼠特有的CD8+ T细胞群，这些细胞能够抵抗晚期衰竭并保持在高细胞毒性状态。T细胞受体 (TCR) 序列数据证实，与健康对照相比，该种群表现出增加的克隆扩增，表明它们对胰岛抗原有反应。重要的是，最丰富的CD8+ T细胞克隆与胰岛特异性葡萄糖6-磷酸酶相关蛋白抗原特有的TCR共享几乎相同的CDR3序列，并且已知会驱动糖尿病发病机制。这些发现建立了驱动STAT3-GOF糖尿病的细胞类型特异性机制，最终阐明了由一个突变引发的复杂自身免疫反应，并将CD8+ T细胞作为预防和治疗T1D的可能治疗靶点。
单细胞技术--更精确地治疗自身免疫性疾病
目前，自身免疫疾病的单细胞测序方案涵盖单一组学技术Single cell RNA-seq或Single cell ATAC-seq以及Single cell RNA-seq结合Bulk RNA-seq的多组学测序方式来阐述疾病的发生机制或进行疾病标志物的筛选。对于尚未开展单细胞研究的自身免疫疾病可以参照上述已有的单细胞测序方案以及取样方式（病灶组织或外周血）进行。随着单细胞测序技术的发展，Single cell RNA-seq、Single cell ATAC-seq以及单细胞免疫组库测序（Single cell BCR-seq/ Single cell TCR-seq）技术已经日趋成熟，采用以上组学的多组学联合测序策略对自身免疫疾病的发病机制以及标志物筛选研究将开启新征程。
参考文献：
[1]https://www.fnih.org/our-programs/AMP/amp-ra-sle
[2]Nehar-Belaid D, et al. Mapping systemic lupus erythematosus heterogeneity at the single-cell level. Nat Immunol 21: 1094–1106 (2020). doi: 10.1038/s41590-020-0743-0.
[3]https://www.cdc.gov/lupus/facts/detailed.html#sle
[4]https://www.cdc.gov/diabetes/basics/what-is-type-1-diabetes.html
[5]Warshauer JT, et al. A human mutation in STAT3 promotes type 1 diabetes through a defect in CD8+ T cell tolerance. J Exp Med 218: e20210759 (2021). doi: 10.1084/jem.20210759.
[6]Flanagan SE, et al. Activating germline mutations in STAT3 cause early-onset multi-organ autoimmune disease. Nat Genet 46: 812–814 (2014). doi: 10.1038/ng.3040.
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