今天分享一篇发在MP上浙大的一篇文章，研究是一种棉花的子叶。
文章背景：
色素腺体（pigment gland）是棉属（Gossypium）特有的防御结构，其主要内含物棉酚在棉花病虫害抗性中起重要作用，但因其对人类和动物的毒性，反而限制了棉籽中丰富的油分及蛋白质的利用。比克氏棉（Gossypium bickii）具有优良的“子叶色素腺体延缓形成”性状，其色素腺体在种子萌发过程中形成，是研究色素腺形态建成的理想材料。比克氏棉种子无色素腺体低棉酚，有利于充分利用棉籽资源。
实验设计：
该研究利用萌发48h比克氏棉子叶（色素腺体形态发生的活跃阶段）作为样本制备原生质体，利用10× Genomics单细胞转录组测序技术。
结论：
1. 构建了比克氏棉花的单细胞转录组图谱
共获得了12, 222个单细胞转录组，鉴定出8个主要细胞类群。其中色素腺体细胞类群与其他细胞类群显著分离.（下图B中的cluster 10），并利用RNA原位杂交技术验证了该细胞类型特异性标记基因。然后作者根据不同cluster的marker基因筛选了一些新的marker gene，并利用原位杂交验证了一些新的marker 基因，例如下图E。
2. 构建色素腺体细胞的发育轨迹
然后，作者又单独把cluster 10聚类，发现可以细分为色素腺体薄壁细胞、分泌细胞和凋亡细胞（下图A），对这些sub-cluster的定义，主要根据腺体发育的有关marker基因（下图B）。然后作者又重构了这些腺体细胞的发育轨迹（下图C），从发育轨迹来看，也是从Parenchyma cell就是薄壁细胞开始，到分泌细胞，再到凋亡细胞的。而棉酚合成相关的重要基因也基本在分泌细胞表达的。然后为了揭示整个色素腺体的发育过程和调控网络，作者鉴定了649在发育轨迹上其中重要作用的功能基因。这些重要的调控基因可以继续分为5个module。从每个module富集的功能来说也是和色素腺体的发育过程相符的。
3. 构建调控色素腺体发育的转录因子调控网络
从发育轨迹，作者发现很多重要的转录因子家族在色素腺体的发育过程中都产生中重要的作用。所以作者尝试构建转录因子对于色素腺体的调控网络。但是文中，我觉得有点突兀，突然就提了转录因子GoPGF，说这个是已经证明的一个非常重要的参与腺体发育的转录因子，前面原位杂交结果也证明了它在色素腺体里面表达（但是marker基因并没有展示）。
基于此，后面对于转录因子的调控网络考虑都是基于GoPGF的。做了GoPGF的DAP-seq去鉴定GoPGF的下游靶标。然后文中描述：And by integrating the results of DAP-seq and scRNA-seq, a TF network with GoPGF as the hub gene was established. AP2/ERFs, bHLHs, C2H2s, MYBs, NACs and WRKYs were shown to be the major interactors of GoPGF involved in the regulation of the formation of pigment gland parenchymal cells or release of gossypol from apoptotic cells。换句话说，这个转录因子调控网络是围绕GoPGF来构建的。这些其它互作的AP2/ERFs, bHLHs, C2H2s, MYBs, NACs，WRKYs转录因子不确定是DAP-seq找的，还是仅仅通过单细胞那些共表达找的。下图C也只是highlight了几个转录因子在发育轨迹上的表达而已。最后，作者提出了一个相对完整的色素腺体形态建成的模型（下图D）。
然后，作者又收集了不同萌发阶段比克氏棉子叶的转录组，发现这些大部分的基因是随着萌发升高的。然后作者利用VIGS对调控网络的核心转录因子进行了功能验证，证实了bHLH、NAC和MYB等转录因子在色素腺体发育中的调控作用（下图B，C，D）。
4. 光和GA调控了色素腺体的形成
其实第一次看这部分的逻辑的时候，我也没看的特别懂。
文中是这样说的：Guided by the bulk samples of cotyledons (0, 12, 24, 36 and 48 h after seeds imbibition) in G. bickii with pigment gland density information, 45 Scissor+ cells and 57 Scissor− cells were selected in pigment gland cells, which were associated with the pigment gland density phenotypes.
直白点的理解就是，基于手头不同时间点0,12,24,36,48小时的数据，而这些数据是有色素腺体密度信息的。所以作者删选了45个和57个两个不同的cell group，而这些cell group是和色素腺体相关的。也就是通过基于0,12,24,36,48h的表型数据，进行了单细胞的筛选（至于具体怎么筛选的，我看方法是Scissor，第一次见，后面也会去学习一下）。我的理解有点类似WGCNA表型和module的关联，这不过那个module是基因的list，这个module是cell的list。
针对挑出的两组cell，作者说做了富集分析，我也没看明白如何做的富集，挑出这些cell中表达的基因吗？富集结果表明有很多光合作用相关的通路。所以作者又把这些cell中相关的TF进行了promoter区域binding sites预测，发现很多和光以及GA相关的结合位点（下图A）。
基于这个发现，作者开始测试光和GA在色素腺体形成过程中的作用。分别设计了几组实验：黑暗条件下；黑暗+GA；黑暗+GA抑制剂；光照条件；光照+GA；光照+GA抑制剂。选取36、48、60、84小时。可以看出黑暗条件；黑暗+GA抑制剂；光照+GA抑制剂的几乎都没有色素腺体（下图B和C）。
紧接着，对于作者预测模型的关键TF，作者也查看了在缺光条件下表达值的变化；对于棉酚合成相关的基因，也是和这些转录因子一样，很多都是在黑暗条件下上调的。
所以总的来说：该研究利用单细胞测序技术和比克氏棉色素腺体的独特性状，描绘了首个棉花子叶单细胞转录图谱，揭示了色素腺体的发育模式，构建了其转录调控网络，挖掘了色素腺体相关的重要基因位点，为色素腺体形态发生提供了新的见解。同时，为进一步探索子叶色素腺体延缓形成的机制，培育种子无色素腺体、植株有色素腺体的新型低酚棉栽培种提供了理论基础。
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