2023-09-19一篇文章终结你对单细胞核测序的所有困惑

单细胞测序（single-cell sequencing）是解析生物学现象强有力的技术手段

自19世纪30年代细胞学说提出以来，“细胞是生命活动的基本单位”这一概念便成为生物学研究和发展的基石，近200年来的实验不断证明，我们只有了解细胞的特性与功能，才能深入理解生命现象的深层机制，才能明晰生物体生长发育的规律，才能辨明疾病发生发展的原因。

任何生物学过程都是通过复杂的细胞及分子的网络相互作用来推进和完成的。任何组织正常的生理功能均依赖于适当的信号通讯及其相互作用。每个细胞均拥有其特定的功能，不同类型的细胞相互协调、发挥各自功能，从而组成各种生命体，因此，生命本质上是不同类型的细胞之间的相互作用网络，且这一网络处于时刻不停的动态变化之中。

生命的这种本质特征，决定了生命现象背后都是动态的网络相互作用，其复杂性超乎想象。按照传统生物学方法去研究生命现象是无法解析其背后的运作机制的。只有通过高通量的组学技术，一次性对众多的网络变量（细胞）进行测量，我们才可能挖掘出生命现象背后的深层机制。因此，只有充分解析细胞网络的特性和运作原理，我们才可能理解细胞作为生命活动的基本功能单位，是如何推动各种生命现象发生和发展的。

单细胞测序（single-cell sequencing）正是解析细胞网络强有力的技术手段。它通过绘制组织或器官的细胞图谱，明确细胞的分子调控模式和状态变化，为我们理解生命的细胞互作网络提供了单细胞分辨率的系统性洞见。近年来单细胞测序文献的持续快速增长，以及Nature Methods杂志2013年将单细胞测序技术评选为年度技术[1]，随后又在2019年将单细胞多组学技术评选为年度技术[2]，这些情况充分证明了该技术对生命科学研究的重要性。

受限于样本解离过程，单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing， scRNA-seq）目前存在三大问题

scRNA-seq是应用广泛的单细胞测序技术，目前已经走过了十个年头，随着在科研领域大量应用的展开，scRNA-seq逐渐显示出一些固有的方法学问题，主要有三点。

第一，仅适用于新鲜组织样本，对于冻存样本，由于细胞已经丧失活性，因此无法开展scRNA-seq。这一点极大的限制了单细胞测序技术的应用范围，同时也增加了操作的难度，降低了样本通量。例如，许多临床样本为了保证RNA的稳定性，需要进行冷冻，而这样的临床存档样本（archived frozen samples）是无法进行scRNA-seq，直接导致很多具有重要科研和临床价值的冻存样本无法通过zui新的技术进行研究。

第二，解离过程会诱导应激基因的表达，引起细胞转录模式发生“人为改变”（artifactual transcriptional stress responses），造成转录偏好（bias）。这样获得的数据无法真实的反应样本的细胞转录状态，结果的可靠性大大降低。

这一点已为众多实验所证实。Brink 等人就发现，37℃进行蛋白酶解离的过程会诱导应激基因的表达，引入人为误差，造成细胞类型鉴定结果失准[3]。Adam等人也发现，37℃解离会造成细胞转录组的“人为改变（artifactual changes）”，导致结果不准确[4]。而zui新的对比实验进一步证实了这一现象：37℃解离诱导大量应激基因的表达量升高，会造成结果严重失真，而采用低温解离步骤能够有效避免这一现象[5]。

第三，对于很多实体组织，如脑、心脏、肾脏等，蛋白酶倾向于将易于解离的细胞类型解离下来，因此会丢失不易解离的细胞；同时一些较为敏感的细胞可能会因为解离过度而破碎。这样，解离过程无法有效的获取到组织中的所有细胞类型，结果的准确性大为降低。

例如脑部的齿状回组织（dentate gyrus tissue）无法通过常规的解离手段获得完好的细胞，因此这一组织中的细胞类型非常容易丢失[6]。脑部的新生神经元（newborn neurons）也会遭遇同样的情况[7]。这一情况在肾脏组织的scRNA-seq中也同样会出现[8]：肾小球足细胞（glomerular podocytes）, 肾小球系膜细胞（mesangial cells）, 以及内皮细胞（endothelial cells）都无法通过scRNA-seq得到鉴别。对肺脏的scRNA-seq结果显示，上皮细胞比例严重失真，而部分稀有细胞类型则无法得到鉴别[9]。目前商业化的单细胞平台都对细胞大小有限制，都会使用细胞筛过滤掉不规则的、大的细胞，造成特定细胞类型的丢失，无疑将对数据的解读和生物学机制的阐释产生重要影响，结果的准确性无法得到保证。

单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）为解决样本解离引发的问题提供了完善的技术方案

使用细胞核进行单细胞测序（single-cell sequencing）的历史由来已久，对基因组进行分析的文献可以追溯到2011年，Navin等研究人员通过分离肿瘤组织细胞核，对单个细胞的CNV进行鉴定[10]，以此揭示肿瘤组织的细胞异质性。近年来关于通过细胞核进行单细胞基因组分析的文献也多有报导[11,12,13]。而snRNA-seq则可以追溯到2013年[6]，作者针对脑组织难以解离获得完整细胞的问题，通过细胞核RNA进行单细胞转录组分析。人类细胞图谱计划（HCA Project，Human Cell Atlas Project）主要负责人之一的Aviv Regev，其课题组在以往的脑组织scRNA-seq研究中发现稀有的神经细胞难以得到鉴定，因此开发了专门的snRNA-seq方案：Div-seq[7]，并在随后进一步开发了DroNc-seq[14]，用以解决scRNA-seq难以获取完整细胞类型的问题。在同一时期，加州大学张鹍教授课题组同样通过细胞核对尸检后的脑组织进行snRNA-seq，以扩展单细胞转录组分析的样本类型，证明了来自临床的冻存样本完全可以进行单细胞转录组分析[15]。

在这些早期研究的引领下，snRNA-seq逐渐呈现出较为火热的研究景象。特别是脑组织的单细胞转录组研究，目前多数文献均倾向于使用snRNA-seq而不是scRNA-seq[16~27]。迄今为止，snRNA-seq已在多种组织类型中得以应用，包括肌肉组织[28]，心脏[29,30,31,32]，肾脏[5,8,33,34]，PBMC或培养细胞系[35,36,37]，血管[38]，肺脏[9]，胰脏[39]以及多种肿瘤组织[40]。这些文献的结果一再表明，snRNA-seq相比scRNA-seq具有其明显的优势，将有力的促进我们更全面的理解组织的细胞发育和分化。

snRNA-seq能够获得更为可靠和准确的结果，更加充分了解组织的细胞异质性和细胞的分化、发育状态

经过近年来的大量数据积累，已经可以确定snRNA-seq能够解决scRNA-seq中存在的主要问题，具有以下几点突出的优势。

第一，样本类型大大扩增，且操作步骤大为简化而稳定。

细胞核膜相比细胞膜更为坚固，因此，冻存组织细胞膜破裂后细胞核则能够保持完整。这也是snRNA-seq得以开展的基础。正是基于这一基本特性，snRNA-seq才可应用于冻存组织的单细胞转录组研究，而近年来的研究结果也充分支持对冻存组织的snRNA-seq分析完全可以获得高质量的数据和可靠的结果[5,14,15,40]。另外，由于仅涉及机械破碎和简单的纯化，snRNA-seq操作步骤相对简化，便于开展实验，其稳定性相比scRNA-seq大大提高。

第二，不会引入人为的转录偏好。

冻存组织中细胞的转录组是被“冻结”于采样的时间点，细胞已基本丧失活性，不会再发生转录变化。因此，snRNA-seq不会出现转录偏好的情况，测序结果能够真实反映采样时间点的细胞转录模式，从而获知准确的细胞转录状态，这一点已经在众多文献中得到证明[5,6,8,9]。

第三，能够鉴定到的细胞类型更为全面和完整。

由于采用机械法和化学试剂破碎细胞，snRNA-seq不会出现酶解方法的偏向性，所有细胞类型均能够得到有效回收和鉴定，帮助研究人员获取更加完整和全面的细胞图谱。这一点在多种组织类型中均能获得一致的结果[5,6,7,8,9,14,15,20,30,39,40]，说明snRNA-seq的技术方案是稳定而可靠的。

另外，由于缺失了细胞质中的RNA分子，snRNA-seq在鉴定细胞转录状态中可能不如scRNA-seq，但根据目前的结果来看，snRNA-seq的表现与scRNA-seq完全一致，同样能够准确的捕捉到细胞的转录状态，这一点已在不同组织、不同外界处理条件等多种情况下得到了证实。例如，Lacar等人通过snRNA-seq能够揭示神经元的激活状态[16]。Hu等人能够解析皮质细胞的瞬时转录状态[17]。在心脏疾病模型小鼠中，snRNA-seq能够发现疾病特异性的细胞转录状态[29]。而在心脏正常发育中，心肌细胞的发育轨迹也能得到很好的鉴别[31]。在心脏损伤研究中，细胞分化、发育的状态同样能够清晰的予以显示[32]。在肾脏疾病研究中，snRNA-seq展示了“一如既往”的稳定性，能够揭示细胞的病理变化[34]。在胰脏的正常发育中，snRNA-seq同样能够揭示细胞发育和分化的动态变化[39]。

综上所述， snRNA-seq解决了scRNA-seq中固有的一些问题，能够获得更为准确可靠的结果，因此相比scRNA-seq具有较为明显的优势。

snRNA-seq正在成为一种主流趋势

近3年来，snRNA-seq文献增长趋势较为迅速，特别是国际主流实验室在进行单细胞转录组测序时，均倾向于选择snRNA-seq而非scRNA-seq，说明snRNA-seq正在逐渐变为一种“流行”。例如，Aviv Regev实验室近几年的单细胞测序文献主要是通过细胞核进行的[7,14,22,40]，他们近期的工作也致力于证实snRNA-seq技术方案在肿瘤组织单细胞转录组测序中的有效性和可靠性[40]，为此还开发了专门用于snRNA-seq数据分析的生信流程：Cumulus[41]。加州大学张鹍教授课题组同样主要通过snRNA-seq展开研究[15,34,42]，并开发了专门的多组学技术[42]。

另外，单细胞测序未来主要发展方向应当是提高细胞通量以及单细胞多组学技术。目前能够实现百万级细胞通量的技术方案均是通过细胞核进行测序的[43,44,45]，而单细胞多组学技术也是同样如此[42,46]。

综合以上发展情况，未来单细胞转录组研究有可能将是snRNA-seq占据主要地位，而scRNA-seq由于本身固有的一些问题，将逐步让位于snRNA-seq，仅仅局限在部分针对性的领域中，例如在神经小胶质细胞激活态（microglial activation）的研究中[27]。

基于10x Genomics的snRNA-seq是目前应用广泛的技术方案

对近年来snRNA-seq文献进行分析，能够看到另外一个明显的趋势：基于10x Genomics平台的snRNA-seq正在逐渐占据主流。这一点在2020年已发表的snRNA-seq文献中尤为明显：今年发表的snRNA-seq文献基本都是采用制备细胞核后通过10x Genomics平台完成后续操作[5,9,27,30,32,36,37,39,40]。这应当是由于10x Genomics是目前稳定的商业化平台，能够保证较高的数据质量。在对不同平台的snRNA-seq的系统性比较中，数据也证实了10x Genomics平台的结果是稳定、可靠和准确的[36]。

写在最后

细胞是生命活动的基本功能单位。单细胞测序是目前我们解析各种生命现象、揭示各种生物学机制的强有力的技术手段。snRNA-seq技术以其稳定可靠的结果，将是未来单细胞测序发展的主流技术。随着snRNA-seq数据的积累，我们将会越来越多的将表型、基因型与细胞核的转录模式联系起来，从而越来越清晰的理解生命的种种奥秘。也只有在洞悉这些机理的基础上，结合各种工程学方法，未来我们才能够攻克各种疾病，为人类健康与发展带来福祉。

参考文献

1. Method of the Year 2013. Nat Methods. 2014 Jan;11(1):1.

2. Method of the Year 2019: Single-cell Multimodal Omics. Nat Methods. 2020 Jan;17(1):1.

3. Susanne C van den Brink et al., Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017 Sep 29;14(10):935-936.

4.Mike Adam et al., Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts_ a molecular atlas of kidney development. Development. 2017 Oct 1;144(19):3625-3632.

5. Elena Denisenko et al., Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 2020 Jun 2;21(1):130.

6.Rashel V Grindberg et al., RNA-sequencing from single nuclei. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Dec 3;110(49):19802-7.

7. Naomi Habib et al., Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 2016 Aug 26;353(6302):925-8.

8. Haojia Wu et al., Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis. J Am Soc Nephrol. 2019 Jan;30(1):23-32.

9. Jeffrey R Koenitzer et al., Single nucleus RNASeq profiling of mouse lung: reduced dissociation bias and improved detection of rare cell types compared with single cell RNASeq. bioRxiv 2020.03.06.981407; doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981407

10. Nicholas Navin et al., Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 2011 Apr 7;472(7341):90-4.

11. Jeff Gole et al., Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nat Biotechnol. 2013 Dec;31(12):1126-32.

12. Diane M Bushman et al., Genomic mosaicism with increased amyloid precursor protein (APP) gene copy number in single neurons from sporadic Alzheimer's disease brains. Elife. 2015 Feb 4;4:e05116.

13. Blue B Lake et al., Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nat Biotechnol. 2018 Jan;36(1):70-80.

14.Naomi Habib et al., Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nat Methods. 2017 Oct;14(10):955-958.

15. Blue B Lake et al., Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 2016 Jun 24;352(6293):1586-90.

16. Benjamin Lacar et al., Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nat Commun. 2016 Apr 19;7:11022.

17. Peng Hu et al., Dissecting cell-type composition and activity-dependent transcriptional state in mammalian brains by massively parallel single-nucleus RNA-seq. Mol Cell. 2017 Dec 7;68(5):1006-1015.e7.

18. Blue B Lake et al., A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Sci Rep. 2017 Jul 20;7(1):6031.

19. Anupama Sathyamurthy et al., Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Rep. 2018 Feb 20;22(8):2216-2225.

20. Trygve E Bakken et al., Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 2018 Dec 26;13(12):e0209648.

21. Hansruedi Mathys et al., Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer’s disease. Nature. 2019 Jun;570(7761):332-337.

22. Jellert T Gaublomme et al., Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nat Commun. 2019 Jul 2;10(1):2907.

23. Rebecca D Hodge et al., Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 2019 Sep;573(7772):61-68.

24. Coco Chu et al., The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 2019 Oct;574(7779):543-548.

25. Dmitry Velmeshev et al., Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 2019 May 17;364(6441):685-689.

26. Alexandra Grubman et al., A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nat Neurosci. 2019 Dec;22(12):2087-2097.

27. N. Thrupp et al., Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue. bioRxiv 2020.04.13.035386; doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.13.035386

28. Weihua Zeng et al., Single-nucleus RNA-seq of differentiating human myoblasts reveals the extent of fate heterogeneity. Nucleic Acids Res. 2016 Dec 1;44(21):e158.

29. Peng Hu et al., Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes Dev. 2018 Oct 1;32(19-20):1344-1357.

30.Markus Wolfien et al., Single-Nucleus Sequencing of an Entire Mammalian Heart Cell Type Composition and Velocity. Cells. 2020 Jan 28;9(2):318.

31. Alan Selewa et al., Systematic comparison of Highthroughput Single-cell and Single-nucleus transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation. Sci Rep. 2020 Jan 30;10(1):1535.

32. Miao Cui et al., Dynamic Transcriptional Response to Injury of Regenerative and Non-regenerative Cardiomyocytes Revealed by Single-Nucleus RNA Sequencing. Dev Cell. 2020 Apr 6;53(1):102-116.e8.

33. Parker C Wilson et al., The single-cell transcriptomic landscape of early human diabetic nephropathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Sep 24;116(39):19619-19625.

34. Blue B Lake et al., A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nat Commun. 2019 Jun 27;10(1):2832.

35. Christopher S McGinnis et al., MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nat Methods. 2019 Jul;16(7):619-626.

36. Jiarui Ding et al., Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nat Biotechnol. 2020 Jun;38(6):737-746.

37. Elisabetta Mereu et al., Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects. Nat Biotechnol. 2020 Jun;38(6):747-755.

38. Soumya Korrapati et al., Single Cell and Single Nucleus RNA-Seq Reveal Cellular Heterogeneity and Homeostatic Regulatory Networks in Adult Mouse Stria Vascularis. Front Mol Neurosci. 2019 Dec 20;12:316.

39. Luca Tosti et al., Single nucleus and in situ RNA sequencing reveals cell topographies in the human pancreas. bioRxiv 733964; doi: https://doi.org/10.1101/733964

40.Michal Slyper et al., A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 2020 May;26(5):792-802.

41. Bo Li et al., Cumulus: a cloud-based data analysis framework for large-scale single-cell and single-nucleus RNA-seq. bioRxiv 823682; doi: https://doi.org/10.1101/823682

42. Song Chen et al., High-throughput sequencing of the transcriptome and chromatin accessibility in the same cell. Nat Biotechnol. 2019 Dec;37(12):1452-1457.

43. Alexander B Rosenberg et al., Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 2018 Apr 13;360(6385):176-182.

44. Junyue Cao et al., The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis. Nature. 2019 Feb;566(7745):496-502.

45. Sanjay R Srivatsan et al., Massively multiplex chemical transcriptomics at single-cell resolution. Science. 2020 Jan 3;367(6473):45-51.

46.Chenxu Zhu et al., An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nat Struct Mol Biol. 2019 Nov;26(11):1063-1070.