蛋白质含量测定法

蛋白质含量测定法

蛋白质含量测定法
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应,而且对后者的影响还要大得多。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用. 索莱宝公司提供的Bradford 蛋白浓度测定试剂盒可以用于蛋白质含量测定，简单快速。

Bradford 蛋白浓度测定试剂盒
货号：PC0010
规格：2500T
保存：开封使用后请密封保存，本试剂盒自订购之日起九个月内有效。
产品内容：
组成 包装（2500微孔) 保存
5×G250 染色液 100ml 2-8℃
PBS稀释液 30ml 2-8℃
蛋白标准(5mg/ml BSA) 1ml -20℃
产品简介：
考马斯亮兰G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由 465nm变为 595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值 A595 与蛋白质浓度成正比。Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，样品中巯基乙醇的浓度可高达 1M，二硫苏糖醇的浓度可高达 5mM，但受略高浓度的去垢剂影响，需确保 SDS 的浓度低于 0.1%，Triton X-100 低于 0.1%，Tween 20, 60, 80 低于0.06%。含去垢剂的样品推荐使用索莱宝生产的 BCA蛋白浓度测定试剂盒。
操作说明：操作说明：
一．微孔酶标仪法
1. 完全溶解蛋白标准品，取 10ul，稀释至 250ul ，使终浓度为 0.2mg/ml。待测蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl或 PBS 稀释标准品。
2. 5×G250 染色液使用前请颠倒 3-5 次混匀，取 1ml 5×G250 染色液，加入 4ml 双蒸水，混匀成 1×G250染色液，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。
3. 将标准品按 0,2,4,6,8,12,16,20 微升分别加到 96 孔板中，加 PBS 稀释液补足到 20 微升。
4. 将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2 倍、4 倍、8 倍稀释），加 20 微升到96 孔板的样品孔
中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2 后。
5. 各孔加入 200 微升稀释后的 1×G250染色液，室温放置 3-5 分钟。
6. 用酶标仪测定 A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。
7. 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
二．分光光度计法
如无酶标仪，染色反应可在离心管中进行，反应液混匀后加入比色皿中，使用分光光度计测定吸光值。
步骤如下：
1. 取八支（或者更多）干净的 10ml 离心管，标记上号。
2. 取 100ulBSA加入 PBS 2.4ml 稀释至终浓度为 0.2mg/ml。
3. 5×G250 染色液使用前请颠倒 3-5 次混匀，取 10ml 5×G250 染色液，加入 40ml 双蒸水，混匀成 1×G250 染色液，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。
4. 按下表加入试剂(以每孔 5ml 计，多余的用来清洗比色皿)
离心管号 1 2 3 4 5 6 7（样品管 1） 8（样品管 2） 9（样品管 3）
标准蛋白 BSA 0ul 100ul 200ul 300ul 400ul 500ul 500ul 适当稀
释的样品 1
500ul 适当稀
释的样品 2
……
PBS 500ul 400ul 300ul 200ul 100ul 0ul 0ul 0ul 0ul
1XG250 染色液 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml
5. 反应 3 分钟后测 OD 值。为了实验的准确性，可每间隔 2 分钟加一管染色液，每间隔 2 分钟测一管 OD
值。如下表：
离心管号 1 2 3 4 5 6 7 8 ……
加染色液（分钟） 0 2 4 6 8 10 12 14 ……
测 OD值 3 5 7 9 11 13 15 17 ……
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。

本篇文章转自生化试剂。