叶片中临时淀粉的正常代谢对保证作物光合作用、延缓衰老和保持高产具有重要作用。酪蛋白激酶 I1（OsCKI1）在很多重要生理过程中起着至关重要的调节作用，包括水稻的根系发育、激素信号传导和低温处理适应性生长。然而，它在调节暂时性淀粉代谢或叶片过早衰老方面的潜在作用仍不清楚。本研究利用多组学研究思路，对osckI1 等位基因突变体lses1（叶片淀粉过量和衰老1）及其野生型品种（WT）的叶片进行了表型组、转录组和蛋白质组分析，揭示OsCKI1在水稻叶片中的分子调控机制。
01 文章详情
文章题目：Integration of transcriptomic and proteomic analyses reveals several levels of metabolic regulation in the excess starch and early senescent leaf mutant lses1 in rice
中文题目：转录组和蛋白质组联合分析揭示了水稻叶片淀粉过量和早衰突变体lses1的几种代谢调节水平
发表时间：2022.03
期刊名称：BMC plant biology
影响因子：5.260
实验方法：mRNA测序+iTRAQ LC-MS/MS 蛋白质组检测
DOI：10.1186/s12870-022-03510-2
02 研究思路
03 研究内容
1、突变体lses1叶片的表型和生理特性
研究者观察发现三叶期前lses1突变体和野生型（WT）之间的表型没有差异。从三叶期开始，突变体较老的叶片在叶尖位置开始枯萎，表现出过早的叶片衰老表型，随发育过程枯萎程度加深，并往较高的叶位发展。突变体叶片中淀粉含量在早晚的测定结果均高于WT，但突变体自身的含量早上6点略低于晚上6点。用碘-碘化钾染色发现晚上6点突变体和WT的三个叶位叶片均能被染成深蓝色，但突变体的颜色稍暗，早上6点WT的叶片颜色为浅黄褐色，而突变体的叶片呈现不同程度的蓝色。这说明突变体叶片白天光合作用产生的淀粉在夜间未完全分解和利用。此外，研究者还测定了突变体和WT叶片中的多种指标，发现突变体叶片膜脂过氧化作用增强，ROS清除系统失衡，叶绿素降解。
Fig.1 野生型 (WT) 和 lses1 突变体的表型和生理特征
2、DEG的鉴定和分析
为了分析突变体和WT的基因表达情况，研究者利用mRNA测序技术发现了4989个差异表达基因（DEG）并聚类成2个模块。GO-BP富集结果表明与细胞凋亡和淀粉代谢相关的几个类别显著富集，包括碳水化合物代谢过程、氧化还原过程、淀粉代谢过程、对非生物刺激的反应过程、核苷酸代谢过程、酒精代谢过程和色素代谢过程。有趣的是LSES1的表达没有显著差异，这表明LSES1的单碱基错义突变不影响转录的积累。
Fig.2 WT和 lses1突变体之间 DEG的鉴定和分析
3、DEP的鉴定和分析
利用质谱技术进行蛋白质组检测发现了568个差异表达蛋白（DEP），455个上调，113个下调。与预期相同，LSES1蛋白在lse1突变体中没有表达，这表明LSES1的单碱基错义突变导致的氨基酸替换可能改变了蛋白质的结构。对DEP进行GO富集分析发现在生物过程类别中，翻译是富集程度最高的，其次是细胞生物合成过程、生物合成过程和单糖代谢过程。在细胞成分类别中，细胞质部分是富集度最高的亚类，其次是细胞质、胞质部分和核糖体。在分子功能类别中，结构分子活性居首位，其次是核糖体结构成分、rRNA结合和RNA结合。
Fig.3 WT和 lses1突变体之间 DEP的鉴定和分析
4、PPI网络中的功能类群
为了探索DEP的生物学特性，通过STRING数据库整合这些蛋白质的相互作用，并用Cytoscape 的 MCODE 插件根据默认参数对蛋白质进行聚类分析，总共确定了四个高度相关的功能类群。值得注意的是，PPI（蛋白质-蛋白质相互作用）网络中发现了两种糖代谢相关蛋白质、四种细胞增殖相关蛋白和两种磷脂代谢相关蛋白质。对这四个功能类群的蛋白进行GO-BP富集分析，发现几个关键过程显著富集在这四个类群中：蛋白质代谢过程、大分子代谢过程、光合作用、质体组织、分解代谢过程、己糖代谢过程、脂质代谢过程和有机酸过程。总的来说，在研究 lses1 叶片过量淀粉形成和早衰表型方面，这些结果强调了PPI网络分析的潜在作用。
Fig.4 PPI网络的功能聚类分析
5、碳水化合物代谢和细胞凋亡代谢相关基因/蛋白
为了更全面地阐明水稻叶片临时淀粉和早衰的调控机制，研究者从WT和突变体中筛选了与碳水化合物代谢和细胞凋亡代谢相关的差异表达基因/蛋白。其中参与碳水化合物代谢的有339个DEG和91个DEP，几个淀粉和糖类代谢相关基因在转录和蛋白质水平上呈现出一致的变化趋势，例如编码葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶大亚基(AGP-L)、类叶绿体麦芽糖过剩蛋白1(MEX1)、可溶性淀粉合成酶1(SSS1)、蔗糖合成酶1(SUS1)、果糖激酶2(FRK-2)、焦磷酸-6-磷酸果糖1-磷酸转移酶亚基(PFP-ALPHA)、胞质丙酮酸激酶同工酶(PK)、苹果酸脱氢酶(MDH)、酒精脱氢酶1(ADH1)和海藻糖-6-磷酸合成酶3(TPS3)的基因都表现出转录和蛋白丰度的增加。这些基因/蛋白的上调和下调可能导致叶片碳水化合物代谢的失衡。
参与细胞凋亡相关代谢的有510个DEG和158个DEP，其中，编码参与清除ROS的L-抗坏血酸过氧化物酶(APX1；APX3)、参与磷脂代谢的非特异性脂转移蛋白(nsLTP2)以及参与核酸代谢的腺嘌呤磷酸核糖转移酶形式2(APRT)的基因都在mRNA和蛋白质水平上受到调控。与ROS产生相关的几个基因/蛋白质，如蛋白质光系统I铁硫中心(psaC)和编码细胞色素Bc1复合亚单元(CR7)的基因，在突变体中分别显示出蛋白质丰度和转录水平的增加。此外，与叶绿素代谢相关的基因，如编码叶绿体蛋白STAYGREEN(SGR)、推测的红色叶绿素分解代谢还原酶(rccR)和ABC转运蛋白C(ABCC3)的基因，在突变体中的转录水平高于WT。综上所述，这些基因在转录/蛋白水平的变化揭示了叶片中叶绿素代谢和氧化还原动态平衡的变化，这与之前的生理特性检测结果基本一致。
Fig.5 与碳水化合物和凋亡代谢相关的差异表达蛋白/基因统计
6、由差异表达基因/蛋白质介导的多重代谢调节
最后，研究者基于上述研究结果，绘制了一个可能的代谢调控机制图，用于解释突变体叶片中的多重代谢水平变化。35个基因被用来描述突变体叶片中与碳水化合物代谢、氧化还原稳态和细胞信号传导相关的通路，并标记了每个基因在转录和蛋白质水平上的变化。结果表明，暂时性淀粉的过度积累可能是导致突变体叶片早衰和碳水化合物代谢失衡的主要因素，突变基因LSES1/OsCKI1可能通过ABA介导的信号通路调节淀粉代谢和细胞凋亡。
Fig.6 lses1突变体中差异表达基因/蛋白质介导的代谢调节示意图
04 结果总结
本研究发现与WT相比，lses1突变体表现出叶片淀粉过量和明显的叶尖枯萎表型、ROS和MDA含量高且叶绿素含量与保护酶活性低。几个与碳水化合物代谢和细胞凋亡相关的重要基因在mRNA和蛋白质水平上的变化是一致的。PPI网络可能在探究 lses1 叶片过早衰老方面发挥辅助作用。转录组学和蛋白质组学整合分析表明，与淀粉和糖代谢、细胞凋亡和 ABA 信号传导相关的多个关键基因/蛋白质显著差异表达。临时淀粉异常增加与淀粉生物合成相关基因的表达高度相关，这可能是导致lses1叶片早衰和叶片多重代谢水平发生变化的主要因素。此外，四种与 ABA 积累和信号相关的蛋白质，以及三种与淀粉生物合成相关的 CKI 潜在靶蛋白在 lses1 突变体中上调，表明LSES1可能通过磷酸化与 ABA 信号和淀粉合成代谢途径交互，影响暂时性淀粉积累和叶片过早衰老。
参考文献：
Chen, Zhiming et al. “Integration of transcriptomic and proteomic analyses reveals several levels of metabolic regulation in the excess starch and early senescent leaf mutant lses1 in rice.”BMC plant biology vol. 22,1 137. 23 Mar. 2022.
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