来源：「高分子材料科学」微信公众号
1 原理介绍
凝胶渗透色谱 (Gel Permeation Chromatography，GPC) 也称为体积排除色谱或尺寸排除色谱，是液相色谱的一个分支，是高聚物表征的重要方法之一。
GPC是利用高分子溶液通过填充有微孔凝胶（固定相，可分为有机凝胶和无机凝胶）的柱子把高分子按尺寸大小进行分离的方法。GPC实验能测定聚合物的分子量及分子量分布，确定聚合物支化度及共聚物组成等。优点是快速、简便、重复性好、进样量少，可实现高度自动化。
GPC的固定相是表面和内部有着各种各样、大小不同的孔洞和通道的微球，可由交联度很高的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、葡萄糖和琼脂糖的凝胶以及多孔硅胶、多孔玻璃等来制备。
在色谱柱中加入高分子溶液，用溶剂淋洗时，体系处于动态平衡状态。聚合物分子在柱内流动过程中，不同大小的分子程度不同的渗透到柱内有大小孔径分布的载体的空洞中去。体积大于凝胶空隙的分子，由于不能直接进入空隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱。小分子可以渗入凝胶孔隙中而完全不受排阻，在孔隙中随流动相流动，后流出色谱柱。中等分子介于上述两种情况之间。如下图所示。
随后可得出高分子尺寸大小随保留时间（或保留体积VR、淋出体积Ve）变化的曲线，即分子量分布的色谱图（如图2所示）。
高分子在溶液中的体积决定于相对分子量、高分子链的柔顺性、支化、溶剂和温度，当高分子链的结构、溶剂和温度确定后，高分子的体积主要依赖于相对分子量。基于上述理论，GPC的每根色谱柱都是有极限的，即：排阻极限和渗透极限。排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量，所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，不但达不到分离的目的还有堵塞凝胶孔的可能；渗透极限是指能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量，如果两种分子都能全部进入凝胶颗粒孔穴内部，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。所以，在使用GPC测定相对分子量时，必须首先选择好与聚合物相对分子量范围相配的色谱柱。对一般色谱分辨率和分离效率的定指标，在凝胶渗透色谱中也被沿用。
2 GPC柱的填料
GPC是以有机溶剂（氯仿，THF,DMF)等为流动相，与之相匹配的填料是疏水性的，其分离对象一般是油溶性的高分子物质，填料的粒度及粒度分布、孔径或孔径分布以及孔容是基本参数。根据凝胶的材料来源可以把它们分为有机和无机凝胶两大类。
2.1有机凝胶
交联聚苯乙烯是一种应用很广的有机凝胶，它是苯乙烯和二乙烯苯的共聚物，一般以悬浮聚合或分散聚合方式制成苯乙烯-乙烯基苯多孔微球，以致孔剂制出所需孔径和孔容。这类凝胶的特点是孔径分布比较宽，分子量分离范围比较大，且柱效高。主要用于非极性有机溶剂，丙酮、乙醇一类极性溶剂不能应用。在有机溶剂中，有机凝胶通常都处于溶胀状态对不同的溶剂溶胀因子各不相同，因此不能在柱中直接更换溶剂，进样时也不能带进大量不良溶剂和空气。
2.2 无机凝胶
在无机基质材料中最重要最基本的是硅胶，多孔硅胶的特点是化学惰性、热稳定性和机械强度好，使用寿命长，可在柱中直接更换溶剂。以硅胶为基质的无机凝胶的最大问题是其表面残余硅羟基所导致的“二级效应”，它会使GPC谱图复杂化。为解决这一问题，通常通过与小分子硅烷化试剂的作用，尽可能地将表面残余的硅羟基加以覆盖。由于多孔硅胶的机械强度很高，因此在交联聚苯乙烯凝胶之后，细粒度的多孔硅胶已经发展成为一种很好的高速、高效凝胶色谱填料。
多孔玻璃是一类和多孔硅胶很相似的无机凝胶，它是碱性硼硅酸盐玻璃经高温分相，再用酸洗去碱性可溶相的产物。它的优点是可以做到孔径分布很窄，对某一分子量范围的分离特别有效，选择性强；孔性结构好有利于试样分子的传质过程。缺点是质脆易碎，柱子装填不紧，柱效低。
2.3 流动相
做GPC检测时首先要考虑被测样品的溶解情况，以此确定流动相，还要考虑柱子的测试范围，应使被测物分子量落在柱子的分子量-淋出曲线线性部分之内，若柱子范围太窄则可考虑将不同规格的柱子串联使用。对于适用于GPC仪器的每一根柱子都会配有详细的使用说明，使用之前应认真阅读，严格遵从，特别值得注意的是严禁超压（超流量），否则会降低柱效、损毁柱子。
3.几款SEC凝胶色谱柱：
3.1SRT凝胶色谱柱
SRT SEC键合固定相采用专利的表面修饰技术，通过在高纯度具有良好机械稳定性的硅胶基质上，键合一层均匀的纳米厚度中性亲水薄膜而制备得到。工艺采用可控的化学修饰技术，因此能确保色谱柱与色谱柱之间有着可靠的重现性。SRT填料采用化学键合技术，表面亲水涂层覆盖完全，因此不仅具有优异的稳定性，而且对蛋白等生物样品的非特异性吸附作用也非常小。精心设计的大孔体积可保证高的分离容量以及优异的分辨率。广泛应用于生物分子及水溶性聚合物的分离和检测。
SRT凝胶色谱柱特点：
● 高柱容量、高分辨率
● 宽的pH范围 (pH范围2-8.5)
● 使用寿命长
● 低盐浓度洗脱，适合LC-MS分析
● 对于生物样品无强吸附
● 极低的非特异性吸附, 高的蛋白回收率及活性回收率
● 解决多维色谱分析应用
3.2 Zenix体积排阻色谱柱
Zenix体积排阻色谱柱采用单分散、球形、表面键合了一层纳米厚度中性亲水性薄膜的3 µm硅胶作为填料。3μm的粒径结合大的孔体积使其成为目前国际上分辨率优良的体积排阻柱。成都摩尔科学仪器有限公司独有的表面键合技术保证了填料表面键合的很大化，使其具有高的化学稳定性及小的非特异性吸附。Zenix系列体积排阻柱有100、150及300Å三种孔径选择，广泛的应用于生物分子及水溶性聚合物的分离与分析。
Zenix 体积排阻色谱柱特点：
● 3 μm粒径
● 100、150、300 Å的孔径选择
● 极高的分离效率和分辨率
● 高容量
● 在低和高盐浓度下有高稳定性
● 批间重复性
● 高的蛋白回收率而不破坏生物活性
● 可忽略的非特异性反应
● 蛋白、核酸、寡核苷酸、多肽和病毒类生物分子能实现理想的分析和分离
● 自然多聚体（如：多糖）、合成多聚体和纳米材料（如：纳米颗粒）能够实现理想的分析和分离
3.3 SRT-C凝胶色谱柱
在实际的蛋白分离、分析工作中，科研工作者经常会遇到某些疏水性蛋白及聚合物改性蛋白在常规SEC柱上出峰状态与理论不符的情况。针对此种情况，成都摩尔科学仪器有限公司在SRT系列色谱柱的基础上，专门推出针对该类样品的Sepax SRT-C SEC系列色谱柱。该键合固定相采用专利的表面修饰技术，通过在高纯度的硅胶基质上键合均匀的纳米厚度中性亲水涂层而制备得到。由于采用可控的化学修饰技术，确保了填料批间有着可靠的重现性。SEC填料采用化学键合技术，表面亲水涂层覆盖完全，因此不仅具有优异的稳定性，而且对蛋白等生物样品的非特异性吸附作用也非常小。同时，大的孔体积保证了高的载样量及优异的分辨率
SRT-C 凝胶色谱柱特点：
● 高载量及高分辨率
● 稳定的的批间重现性
● 高的蛋白回收率，且蛋白不易失活
● 极低的非特异性吸附
● 专为疏水性蛋白及改性蛋白（如PEG化抗体）设计
● 适用于常规生物样品的分离与制备
3.4 Nanofilm 系列高分辨率纳米凝胶色谱柱
Nanofilm体积排阻（SEC）固定相是以高纯度具有良好机械稳定性的硅胶为基质，表面化学键合有一层均一、亲水、纳米厚度的中性聚合物薄膜。该固定相的一个特点是可使用低盐浓度，或含有机溶剂的缓冲液作为流动相进行生物样品的分离，并具有高的分辨率和样品回收率。该色谱填料为窄粒径分布的球形硅胶颗粒。孔径规格有150、250、450和950Å。
Nanofilm 系列高分辨率纳米凝胶色谱柱产品特点：
● 高的分辨率和分离效率
● 在高浓度盐溶液中非常稳定
● 高的重复性
● 可在低浓度盐溶液中进行蛋白的分离
● 高的蛋白回收率，并可保持其生物活性
● pH适用范围2-9
版权声明：「水凝胶」是由专业博士（后）创办的非赢利性学术公众号，旨在分享学习交流高分子聚合物材料学的研究进展。上述仅代表作者个人观点且作者水平有限，如有科学不妥之处，请予以下方留言更正。如有侵权或引文不当请联系作者修正。商业转载请联系编辑或顶端注明出处。感谢各位关注！
网友评论