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Ka/Ks分析是生物信息学中最常见的分析之一，它在研究核酸分子进化方面有重要应用，如果你还不知道的话——咳咳！注意听讲了！（敲黑板）
01
“什么是Ka/Ks?”
在遗传学中，Ka/Ks表示的是两个蛋白编码基因的非同义替换率（Ka）和同义替换率（Ks）之间的比例。这个比例可以判断是否有选择压力作用于这个蛋白质编码基因。
好吧，让我们从最基本的道理开始讲起。如果你手头有两个不同物种的同一个基因的序列，比如人和小鼠的p53基因，然后把这两个基因的序列进行比对，你会发现这两段序列有差异（进化！）。再仔细观察，你会发现有些碱基的变化导致了编码氨基酸的变化（非同义替换），有些没有导致编码氨基酸的变化（同义替换）。这是由密码子的简并性造成的，因为3个碱基决定1个氨基酸，所以64种碱基组合决定20种氨基酸，会有冗余出现。一般情况下，第三个碱基变化会造成同义替换，而第一二个碱基的变化会造成非同义替换。
Ka和Ks的计算公式：
Ka=发生非同义替换的SNP数/非同义替换位点数
Ks=发生同义替换的SNP数/同义替换位点数
其中非同义替换位点数就是会造成氨基酸变化的位点数的总和，比如编码丝氨酸（ser）的第一二位碱基。而同义替换位点数就是不会造成氨基酸变化的位点数的总和，比如编码丝氨酸的第三位碱基。对于像第一个方框里面的苯丙氨酸（phe）和亮氨酸（leu）这种情况，第三位碱基的变化只是有可能造成氨基酸的变化，也就是两种不同的氨基酸各占了两个碱基的位点，则在计算非同义替换位点数和同义替换位点数时，各加上1/2，相当于两者平分了这个位点。另外，计算Ka/Ks时，不考虑start codon和stop codon。
好了，现在我们回到上面的人和小鼠的p53基因的例子。我们只需要数一下两个序列发生（非）同义替换的SNP位点数，再除以（非）同义替换位点数，就得到了Ka和Ks值，然后就可以计算Ka/Ks ratio。
“是不是看起来很简单？然鹅，并不是这样。”
上面的计算方法并没有考虑不同碱基之间发生替换的速率的不同，比如，嘌呤之间替换的概率（A=>G）要高于嘌呤替换为嘧啶的概率（A=>C或T），也就是说转换（transition，嘌呤变嘌呤，嘧啶变嘧啶）发生的概率要高于颠换（transversion，嘌呤变嘧啶，嘧啶变嘌呤）发生的概率。很多计算方法都会考虑到这些替换发生概率的不同。
另外，两个物种分化时间的长短也会影响到Ka/Ks的比值。比如有一个位点，原来是A，后来变成了T，再后来又变成了C，虽然发生了两次替换，但最后仅有一次替换被用于计算替换率。再比如有一个位点，原来是A，后来变成T，但同时与它相对应的另一个序列的位点，也发生了A到T的替换，那么我们也是无法用上面的方法来计算替换率。对于这种复杂的情况，我们可以用最大可能性算法来计算最可能的替换率，这里不再详述。
02
“那么Ka/Ks和进化有什么关系？”
细心的小伙伴可能已经看出来了，在上面的密码子表中，同义替换位点比较少。实际上一个基因中大概只有25%的位点是同义替换位点。假设这个基因没有受到自然选择压力，那么根据中性选择理论，非同义替换率和同义替换率应该是相同的。
一般来讲，因为非同义替换会造成氨基酸变化，可能会改变蛋白质的构象和功能，因此会造成适应性的变化，从而带来自然选择的优势或劣势（一般是劣势）。而同义替换没有改变蛋白质的组成，因此不受自然选择的影响（当然这里我们忽略密码子偏好性的影响），那么Ks就能反映进化过程的背景碱基替换率。Ka/Ks的比值就能说明这个基因是受到了何种选择。
长颈鹿的长脖子基因肯定是受到了正选择...........
一般情况下，在某个个体中偶然发生的一个碱基替换（突变），如果没有额外的好处或者坏处的话，慢慢地也就消失了。但是自然选择中会有很多巧合，某些突变就是很幸运地被保留了下来，并且被固定了（突变频率由极小变为100%）。一个这样的突变在一个二倍体种群中被固定的可能性为1/2N，其中N是种群大小。
对于一个没有受到自然选择压力的基因来说，我们可以计算得到这样的结果：Ka/Ks=1。但实际情况下，这个比值都是远小于1的：Ka/Ks<<1，因为一般非同义替换带来的都是有害的性状，只有极少数情况下会造成进化上的优势。
小鼠和大鼠的835个直系同源基因的Ka/Ks比值分布，横坐标的数值代表每个分类区间的中间值，如0.05代表0-0.1的区间。
于是，我们有了下面的分类：
Ka>>Ks或者Ka/Ks >> 1，基因受正选择(positive selection)
Ka＝Ks或者Ka/Ks=1，基因中性进化(neutral evolution)
Ka<<Ks或者Ka/Ks << 1，基因受纯化选择(purify selection)
03
"Ka/Ks能用来做啥？"
人和黑猩猩的基因组差异只有约1.09%，染色体的数目及形态也几乎没有变化，但是仔细去看的话，会发现很多染色体片段的重排，也就是重新洗牌。
动物学家珍妮·古道尔和黑猩猩在一起
2003年发表在Science的一篇研究发现，发生重排部位的基因，其Ka/Ks>1的比例，即受到正选择的比例要显著高于没有发生重排部位的基因。这说明染色体重排与基因功能的分化密切相关，与人和黑猩猩的分化密切相关。
人和黑猩猩染色体非重排部位（上图）和重排部位（下图）基因的Ka/Ks分布，红色线条为Ka/Ks=1的分界线。重排部位受到正选择的基因比例更高。
当Ka/Ks>>1时，基因受到强烈正选择，这样的基因即为近期正在快速进化的基因，对于物种的进化有着非常重要的意义。我们可以根据Ka/Ks ratio筛选部分基因，然后做后期的功能研究，这种方法已经普遍的被应用到分子进化领域，已有多篇文章在Nature，Science等杂志发表。
除了查找快速进化基因，Ka/Ks还能检测基因的功能性，因为假基因（pseudogene）的Ka/Ks比值通常比功能基因更高（大家想想为什么？）。此外，Ks代表了进化过程的背景碱基替换率，因此可以用Ks来反推事件发生的时间，如全基因组多倍化的时间，这在探究物种起源方面有重要应用。在以后的高级篇中，我们会深入探讨这些问题。
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