美文网首页
多组学分析揭示新的治疗靶点和有待开发的疾病生物标志物(IF8+)

多组学分析揭示新的治疗靶点和有待开发的疾病生物标志物(IF8+)

作者: 生信学霸 | 来源:发表于2022-07-28 17:24 被阅读0次

Identification of functional pathways and molecular signatures in neuroendocrine neoplasms by multi-omics analysis

通过多组学分析识别神经内分泌肿瘤的功能通路和分子特征

发表期刊:J Transl Med

发表日期:2022 Jul 6

DOI:  10.1186/s12967-022-03511-7

期刊相关信息

一、背景

        神经内分泌肿瘤(NENs)是一类罕见的、异质性的肿瘤,其分子发病机制是一个未解决的问题。NENs的特点是全身分布,因为它们由神经内分泌系统细胞发展而来,分布于全身。这些肿瘤既可以以散发性形式发生,也可以在遗传性综合征中发生。源自胰腺和胃肠道的NENs,即胃肠胰腺NENs(GEP-NENs)是最常见的形式之一。

        一般来说,NENs的特点是生长速度相对缓慢,能够分泌肽类激素和生物胺,被用作生物标志物。然而,由于非特异性症状和缺乏早期标志物,许多NENs在诊断时显示出转移的特征,使得有时无法确定肿瘤病变的主要部位。除了更准确的分类外,另一个问题是缺乏诊断NEN的特异性标志物。

二、材料与方法

1.数据来源

1)46名NEN患者(甲状腺=17,胰腺=14,肠道=12,肺=3)的肿瘤活体组织

2)从帕多瓦大学医学系(DIMED)的内分泌科获得了20个先前从MTCs(甲状腺髓样癌)分离的RNA的验证集

3)为了在液体活检中验证miRNA,获得了42名NEN患者(6名MTCs和36名GEP-NENs)和34名健康受试者的血清

2.实验流程

1) 核酸提取、突变分析、阵列-CGH分析

2) 转录组分析、small-RNA分析

3) 血清采样、RNA提取、反转录和实时PCR

三、实验结果

01 - 样本选择、组织形态学特征和免疫染色

        本研究分析的患者队列由66个样本组成,包括29个不同等级的GEP-NENs和37个MTCs。其中,46个是冷冻组织或FFPE,用于不同的检测,而20个先前分离的RNA样本代表了MTC转录组学的验证组。此外,对于5个GEP-NENs,作者没有获得原发肿瘤,而是有转移组织(2个肝脏和3个淋巴)。作者应用多组学实验方法来确定改变的基因、编码转录物和miRNAs,特别是影响所研究的NENs的功能途径。

        在可能的情况下,根据可用样本的质量和数量,作者进行了多基因小组测序:RNA-Seq和smallRNa-Seq。对于较小的集合(30个样本),还通过比较基因组学杂交(CGH)阵列进行了分子核型。根据新的组织病理学分类,基于肿瘤分级和细胞分化,将样本分为G1-G2 GEP-NETs、G3 GEP-NECs和MTCs(图1A, D, G, L)。此外还验证了CgA和Syn免疫组化标记物的阳性染色,这些标记物用于常规组织病理学诊断,以确认NENs的肿瘤类别(图1B,E,H,C,F,I),以及CgA和Calcitonin的阳性染色,MTC的特异性免疫组化标记物(图1M,N)。在图1中,显示了上述形态学和组织病理学特征的代表性图像。聚类分析是为了评估在比较FFPE和新鲜/冷冻组织时可能出现的样本变异,显示样本最好根据组织类型分组,而不是根据样本储存和文库制备方法。然而,所有这些变异来源在下游分析中都被考虑到了。

图1 H&E和神经内分泌标志物在NEN肿瘤中的表达类别

02 - 评估NENs的多基因突变特征

        通过NGS分析从46个冷冻或FFPE NEN-组织中分离出来的DNA,以确定523个癌症相关组织中更可能受序列变异影响的基因。测序后,由于质量低,两个样本被丢弃,无法进行进一步分析。详细来说,该方法可以同时分析来自不同肿瘤组织的多种生物标志物,在一次检测中评估多种变异类型,包括小核苷酸变异(SNVs)、插入、剪接变异和新兴的免疫疗法生物标志物,如肿瘤突变负担(TMB)和微卫星不稳定性(MSI)。

        在对变体进行注释并过滤掉同义变体、基因间变体、覆盖率低于100倍的变体、在普通人群中存在超过5%的变体以及在ClinVar数据库中被注释为 "良性 "或"可能良性 "的变体后,作者确定了5047个突变体。其中大多数是内含子,而近18%是外含子(图2A);仅考虑外含子和剪接变体,超过80%是非同义的SNVs(图2B)。在图2C中列出了所有被检查的NENs中前20个突变的基因,只考虑外显子和剪接变体。有趣的是,在所分析的各种组织中,最频繁突变的基因是DNA损伤检查点蛋白1(MDC1)的介质。这是一个关键的DNA损伤反应(DDR)效应器,通过与TP53相互作用发挥抗凋亡因子的作用,TP53的丢失通常与基因组不稳定性和致瘤性有关。尽管它在同源重组修复中起着关键作用,也包括其他因素,如ATM和BRCA1,这些都是分析样本中最主要的突变基因,但迄今为止,它在NENs中从未被发现有明显改变,尽管它在癌症发展和治疗中的作用正在出现。另一个证据是,与其他大多数基因不同,MDC1在每个样本中大多受到多个变体的影响,这一趋势在NUTM1、ZFHX3和FAT1中较少出现。其余的基因在单个病例中也观察到类似的行为,相反,错义突变最常在全球范围内观察到,而帧移插入或缺失和帧内缺失是零星的事件。

        然后,尽管考虑了所有的NEN样本,但在前20个突变基因中,NUTM1、ERCC4、MAP3K1、MAP3K4、RET和RPS6KB2与其他基因不同,从未在肠道组织中发生突变,而仅在甲状腺和胰腺衍生的肿瘤中发生突变(图2C)。另一方面,考虑到MTC和GEP-NENs的独立情况(图S1),在最主要的突变基因中检索到已知的驱动因素和侵略性标记,如MTC的HRAS和RET(图S1A),GEP-NETs的MEN 1(图S1B),GEP-NECs的RB1和TP53(图S1C)。

图S1 不同NEN类别的突变情况

        对突变基因进行的功能注释分析证实,正如预期的那样,这些基因参与了与基因组稳定性维持有关的途径,如通过同源重组进行DNA修复,DNA损伤反应和检查点调节以及ATM信号传导(图2D)。最后,在分析TMB状态时,考虑到GEP-NEN和MTC组,中位数约为3;当分别考虑NETs和NECs时,在GEP-NEN组内,NECs的中位数明显增加,在某些情况下超过10,这是预测受试者对免疫疗法有反应的阈值(图2E)。相反,MSI定量评分并不具有信息量,这与其他人的观察一致。

图2    44个NENs的突变情况

        上述44个分析样本中的30个样本的DNA也通过CGH阵列进行了分子核型分析,以评估CNVs的存在。GEP-NENs一般呈现多个缺失/重复和几个镶嵌,染色体5、6、7、11、18、22和X主要受影响,而MTCs除了一个病例外,每个样本大多显示单一事件,主要代表缺失(图3A,B)。从先前的的多基因组合测试分析可以识别基因扩增,发现EGFR和BRAF基因都位于7号染色体上,是GEP-NEN样本中最常扩增的基因之一。而最常扩增的RPS6KB1则位于17号染色体上,仅在少数情况下导致重复(图3B)。正如所料,MTC样本没有显示基因扩增事件。

        由于NGS对上述相同的样本集的总RNA进行了测序,另外还有20个只有RNA的样本,因此对数据进行了分析,以评估基因表达数据与所述扩增/缺失模式的一致性以及融合转录物的存在。关于第一点,在大多数情况下观察到DNA重排和基因数量之间有明显的对应关系。这一点在19号染色体和22号染色体上得到了缓解,在19号染色体上,扩增的患者与未扩增的样本相比,同一染色体上的基因数总体上有增加的趋势(图3C),而在22号染色体上,显示缺失的患者则出现了相反的情况(图3D)。对于第二点,根据方法中描述的过滤标准,在放弃低质量样本(66个样本中的6个)后,检测到20个融合转录物。其中大多数只在1名患者中发现,少数在2或3名患者中发现(图3A)。有趣的是,尽管MTC组织很少出现融合转录物,证实这种类型的肿瘤中染色体重排事件的频率很低,但在本研究队列中,有两名MTC患者检索到了以前在高级别浆液性卵巢癌中发现的融合物AL391840.3-SH3BGRL2。需要进一步的实验来研究这些重排在NENs发展和患者生存中的功能意义。

图3 NENs的基因组重排

03 - NEN的miRNome剖析

        为了研究miRNA的表达谱,试图鉴定可作为NEN生物标志物的去调控分子,进行了small-RNA-Seq,使623个miRNA在GEP-NENs和MTCs中普遍表达(图4A)。

        对它们在研究样本中表达的靶mRNAs进行功能分析,发现它们参与了神经和内分泌癌症相关的途径,如多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤和胰腺癌的信号传导,以及其他具体参与肿瘤发展和进展的途径,包括上皮粘连连接、TGF-β、PTEN和NGF信号传导(图4B)。由于缺乏配对的或独立的正常组织,不可能确定癌症样本中不同表达的编码和非编码转录产物。尽管如此,仅考虑GEP-NEN组织,作者评估了不同等级之间差异表达的miRNAs的可能证据,情况确实如此。正如其他研究小组已经假设的那样,一组miRNAs,在本研究案例中是52个,在NETs和NECs之间有明显的差异表达,其中一些似乎也能区分肿瘤等级。为了确定可能的循环NENs生物标志物,对3名患者进行了small-RNA-Seq,这些患者的组织和血清样本都是可用的;同样的组织之前进行了多组学分析。这使得两个MTC血清中的186个和176个miRNAs以及一个胰腺NET血清中的232个miRNAs得以识别;其中94%至98%的miRNAs也在相应的组织中表达。然后,考虑到在所分析的组织中表达量最大的100个miRNAs,NETs和NECs之间的差异表达,以及已发表的证据,选择了一组13个miRNAs进行验证。验证队列由MTC和GEP-NEN患者组成;前者被进一步区分为散发性或遗传性(MEN1)。对照组在年龄和性别上完全匹配,总共有34名健康对照组和42名患者;在患者中只有2名是G3 NENs,因此不可能根据分泌的miRNAs对GEP-NEN等级进行分层。具体考虑到被选定的miRNA子集靶向的mRNAs,这些都与ERK/MAPK、mTOR、HIF-1α、p53和ATM信号转导途径有关(图4C)。

        其中一些途径特别是p53和ATM,也受到基因变异的影响(图2D),因此表明在 NEN 发育和进展过程中这种级联的多层次失调。如图4D所示,所有选定的miRNAs在患者中的表达量都比对照组高,其中大多数可以明显区分受肿瘤影响的人和健康受试者。另一方面,根据NEN的起源,即甲状腺(MTC)、胰腺散发性(pNEN)、胰腺家族性(MEN1)或其他(主要包括肠道和肺部NENs)对患者血清进行分组,发现一些miRNAs在特定的亚组中显著失调。具体而言,miR143-3p在MEN1和其他NEN中显着上调,miR144-3p和miR7-5p在MTC和MEN1中显着上调,miR942-5p在MEN1中显着上调(图 4E)。相反,miR-375在所有不同的亚组中均显著上调,它已经被提出作为其他癌症类型的循环生物标志物。然而,这种影响可能是由于亚组的相对规模,需要更大的病例系列来证实这些数据。

图4 NENs组织和血清中的miRNA分析

04 - 临床上可操作的路径预测

        在被调查的NENs中,多组学分析揭示了经常突变和重复的基因、染色体重复/缺失、融合转录物和失调的miRNAs。总的来说,考虑到这些数据,作者进行了功能分析,以突出受影响最大的路径,这些路径可能是治疗这些肿瘤的有用目标。具体而言,考虑到数据集中最频繁扩增的基因,PTEN信号是受影响最明显的(图5A),特别是胰腺NENs。此外,已知与神经内分泌肿瘤有关的NGF信号传导(图5B),包括本研究案例中一些最频繁突变的基因。另一方面,在失调的miRNA靶点中,在图5C中报告了那些明显参与HIF1α信号传导的miRNA(图5C),已知RET在MTCs中被激活。相反,考虑到受基因改变和miRNA失调影响的不同层次的途径,在那些明显富集的途径中出现了描述良好的p53和新关联的ATM信号,前者代表了治疗这类癌症的潜在新治疗目标。事实上,最后一个网络,如图5D所示,包括失调的miRNA靶点、突变的基因,其中MDM2和MDM4都是miRNA的下游靶点,在一些分析的组织中也被检索为扩增的基因,加强了可能的多层次靶向的假设。

图5 功能交互网络

四、结论

        本研究的结果强调了NENs的一种新的分子景观,鉴定了一组可能作为NEN生物标志物研究的循环miRNA,并建议将ATM及其辅助因子作为可能的分子靶点,与目前的治疗方法相结合进行测试。

相关文章

网友评论

      本文标题:多组学分析揭示新的治疗靶点和有待开发的疾病生物标志物(IF8+)

      本文链接:https://www.haomeiwen.com/subject/umuxwrtx.html