大家好！今天给大家介绍一篇2021年11月发表在Cancer Cell International（IF:5.722）上的文章。作者对膀胱癌患者中CXCL12的表达水平进行全面分析，构建iCAFs打分可以预测患者生存期和ICB反应。
Comprehensive analysis of CXCL12 expression reveals the significance of inflammatory fibroblasts in bladder cancer carcinogenesis and progression
全面分析CXCL2表达揭示炎性成纤维细胞在膀胱癌发生发展中的作用
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摘要
背景：膀胱癌（BLCA）是最常见的泌尿生殖系统肿瘤但还缺乏特异性的诊断生物标志物。免疫检查点阻断（ICB）治疗晚期BLCA取得了显著的进展。肿瘤微环境（TME）是影响BLCA患者预后和ICB治疗反应的重要因素。CXCL12是一种基质分泌因子，主要参与调节癌症的TME。本研究，作者深入研究CXCL12在BLCA中TME的调节作用，揭示CXCL12在BLCA的发生发展中的重要作用和与炎症成纤维细胞（iCAFs）的关系。
方法：通过TCGA和GEO数据库研究CXCL12的表达水平，揭示CXCL12与BLCA的发生和预后的关系。ROC曲线研究CXCL12和iCAFs相关基因诊断BLCA的准确性。使用MCP-COUNTER,ESTIMATE和TIDE评估TME组分并预测ICB反应，使用ssGSEA算法构建iCAFs特征，使用maftool分析BLCA患者突变情况，使用免疫组化进行验证，IMvigor210队列验证预测ICB反应的准确性。
结果：BLCA中CXCL12的表达水平较低，iCAFs标记基因的表达水平较低。CXCL12和iCAFs与BLCA患者的病理特征和TME有关。iCAFs特征进一步证实了iCAFs在BLCA中复杂的免疫调节作用。基因突变分析表明iCAFs与TP53,FGFR3等致癌基因突变频率有关。iCAFs与BLCA患者的TP53和RTK-RAS通路的突变有关。
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流程图
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结果
1. 数据集的获取和下载
从TCGA数据库获取BLCA患者的转录组数据共包括408例患者，从GEO数据库获取GES13507共包括165例患者，获取IMvigor210队列。
2. CXCL12表达水平降低与BLCA癌变有关
在多种肿瘤类型中CXCL12的表达水平较低（图1A和1B）。此外，ROC曲线的AUC表明CXCL12能够准确诊断BLCA（图1C）。
图1 CXCL12表达水平
3. CXCL12表达水平降低与BLCA中iCAFs丰度降低有关
作者对正常组织和BLCA组织进行差异分析鉴定DEGs，其中iCAFs的标记基因在肿瘤组织中表达量下调（图2A）。GO和KEGG富集分析表明含胶原的细胞外基质显著降低，强调了BLCA癌变过程中CAFs的丰度降低（图2B）。ROC曲线表明iCAFs标记基因的降低对BLCA具有较高的诊断价值（图2C）。使用免疫组化检测正常组织和BLCA中CXCL12,PDGFRA和VIM中的表达水平（图2D）。
图2 iCAFs分析
4. CXCL12表达水平与BLCA预后和临床特征有关
对CXCL12high和CXCL12low组研究CXCL12表达水平对BLCA患者OS的影响，CXCL12high组患者的OS较低，表明CXCL12高表达与BLCA预后较差有关（图3A）。临床特征分析表明CXCL12高表达的患者其肿瘤分期较高，临床分期较高和淋巴结转移有关（图3B-3G）。单因素分析表明CXCL12表达水平是一个有害因素（图3H）。
图3 CXCL12对BLCA生存和临床特征的影响
5. CXCL12在肿瘤微环境中具有复杂的调控机制
CXCL12high和CXCL12low组差异分析鉴定到757个上调基因和56个下调基因（图4A）。GO和KEGG富集分析表明DEG富集到细胞因子-细胞因子互作，细胞粘附和ECM受体互作等通路，细胞外结构和细胞外基质组织等功能（图4B）。GSEA分析表明CXCL12在血管生成和缺氧等功能有关，与趋化因子和T细胞受体信号通路有关（图4C）。
图4 CXCL12的功能注释
6. CXCL12与免疫检查点基因，TIICs，基质细胞等有关
CXCL12与免疫检查点基因表达水平相关性分析表明，CXCL12表达水平与PDCD1，PDCD1LG2，CD274，TIGIT和HAVCR2正相关而与SIGLEC15负相关（图5A和5B）。使用MCP-COUNTER研究基质细胞和免疫细胞的丰度，CXCL12与CD8+ T细胞，内皮细胞和CAFs正相关（图5C和5D）。ESTIMATE分析表明CXCL12与基质打分和免疫打分正相关（图5E）。将患者按年龄分为大于65岁和小于65岁，大于65岁患者的CXCL12表达水平较高（图5F），CXCL12与SASP正相关（图5G）。TIDE分析表明CXCL12与TIDE打分正相关（图5H）。
图5 CXCL12与BLCA的TME的相关性
7. 构建ssGSEA相关的iCAFs特征
作者基于iCAF标记基因的ssGSEA构建iCAFs特征，研究iCAFs对BLCA的影响。iCAFs打分高的患者OS较差，随肿瘤分期升高，患者的iCAFs打分升高（图6A）。此外，使用GEO数据集验证iCAFs打分的准确性（图6B）。相关性分析表明iCAFs打分与CXCL12,T细胞和巨噬细胞具有显著相关性（图6C和6D）。ssGSEA分析研究iCAFs参与的功能（图6E和6F）。
图6 iCAFs打分预测BLCA患者预后
8. iCAFs打分与致癌突变，分子亚型和免疫治疗反应有关
在iCAFhigh组中TP53突变频率较高而FGFR3突变频率较低（图7A和表2）。TP53突变患者和未突变患者的CXCL12表达水平和iCAFs打分没有显著差异。FGFR3突变组的CXCL12表达水平和iCAFs较低（图7B）。iCAFs对RTK-RAS和TP53信号通路具有显著影响（表2）。不同分子亚型的患者中，iCAFs打分在纤维母细胞亚型中较高（图7C）。iCAFs打分与T细胞功能失调和排斥有关，iCAFs打分与ICB反应显著相关（图7D）。
图7 iCAFs打分与基因突变，分子亚型和ICB反应的相关性
表1 iCAFs高和iCAFs低组的差异突变基因和通路
9. CXCL12与iCAFs，CD8+ T细胞排斥和临床病理特征密切相关
免疫组化表明肿瘤中瘤内CD8+ T细胞浸润的肿瘤组织表现出CXCL12和PDGFRA阴性表达（图8A）。CXCL12和PDGFRA阳性的肿瘤表现出基质内CD8+ T细胞浸润较高而瘤内浸润较低（图8B）。此外，作者定量和验证了基质区CD8+ T细胞水平（图8C）。此外，作者研究内皮细胞和iCAFs中CXCL12和PDGFRA的表达（图8D和8E）。最后，使用IMvigor210队列验证iCAFs打分与ICB反应的相关性（图8F）。
图8 IHC验证
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结论
作者对TCGA-BLCA数据集进行全面研究，从多个方面证明CXCL12对BLCA患者的预后具有重要影响并使用IHC进行验证。作者的研究强调了iCAFs对BLCA患者肿瘤发生发展的作用，靶向iCAFs为治疗BLCA提供新的思路和信息。本研究的亮点在于作者对研究结果进行了实验验证但是仍然需要大量的数据验证本研究的结果。
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