影响因子：15.805
研究背景：高级别胶质瘤(HGG)的遗传驱动因素已有报道，在成人弥漫性胶质瘤中常见异柠檬酸脱氢酶(IDH)的突变和表皮生长因子受体(EGFR)的扩增，而在儿童HGG(pHGG)中组蛋白H3.1和H3.3的高频突变以及血小板源性生长因子受体(PDGFRA)改变较为常见。 DNA突变可导致癌症已被广泛报道，但在预测肿瘤发生和治疗反应的能力上还不完善，这表明其中有其他机制，包括表观遗传学、转录组学和蛋白质组学在起作用。选择性剪接(AS)增加了转录本的多样性，并已被证明在成人癌症中发生了改变，它有可能通过去除或改变蛋白质结构域和翻译后修饰(PTM)、蛋白质截断来影响癌症基因。在此文中，作者通过多组学方法分析了儿童和成人HGG的选择性剪事件，确定了癌症激活致癌途径的非诱变机制。
研究结果：
一、剪接体突变与pHGG中选择性剪接的增加有关
1、通过调查pHGG队列的突变，我们发现34%的患者至少有一个剪接体突变，包括单核苷酸变异或拷贝数改变(图1a，S1a)。在一个独立的pHGG队列中28%的患者存在剪接体突变(S1b).
图1a：
S1a：
S1b
2、剪接体由多个亚复合物组成，其中许多蛋白质参与一个或多个亚复合物。在整个剪接体生命周期中，核心成分突变是最常见，其中11-23%的患者在任何复合物中都发生了突变(图1a和补充图S1c)。以往研究中，包括SF3B1、U2AF和SRSF2在内的基因的剪接体突变经常发生在其他肿瘤中。
S1c：
3、鉴于频繁的剪接体突变，我们推测pHGG可能容易发生AS的破坏。在64例pHGG和20例正常大脑的RNA-Seq数据中，剪接通路上调(图1b)，与剪接体的直接突变无关，也与差异DNA甲基化无关(补充图S1f）。
图1b：
4、剪接途径的上调也出现在使用来自癌症基因组图谱的RNA-Seq中（图：S1d）。提示这可能是一种常见的神经胶质瘤现象。
S1d：
5、与剪接通路的上调一致，选择性剪接事件(ASE)(rMATS16)分析发现，整个数据集中有247,507个ASE(补充图S2a，b)。与正常大脑相比，在pHGG中发现的904个基因中有1827个差异ASE。844个差异剪接与突变剪接体相关，这些剪接体大多是跳过外显子或互斥外显子，是在给定复合物中突变的肿瘤所特有的(图1e和补充图S1j, k).与剪接体肿瘤相比，亚复合物E（最早的组装阶段）和Bact（催化核心的亚复合物）对AS的影响最大(图1a、e和补充图S1k).
S2a-b：
图1e：
S1 J-k：
6、基于ASEs的无序层次结构聚类和t-SNE分析，可以有效地分离pHGG 和正常大脑(补充图S1g, h)，进而量化pHGG与正常大脑中的选择性剪接。首先，我们发现剪接连接更加多变（补充图S1i)。此外，我们计算了每个多亚型基因的Shannon entropy，无论剪接体突变状态如何，pHGG显著增加，比正常大脑表达更多，(图1c，d)
S1 i：
图1c-d：
二、癌症驱动基因在pHGG的差异剪接事件中富集
1、在pHGG中，共鉴定出904个基因中的1827个差异ASE，主要是跳过的外显子和互斥的外显子事件，(图2a和补充图S2a–c)。我们通过RT-PCR验证了pHGG/正常脑中选择的靶点(补充图S2d)。总的来说，79%的剪接基因没有差异表达，这表明我们鉴定的差异ASE不是表达水平的变化(补充图S2e)。
图2a：
S2a-e：
2、我们将rMATS16识别的靶点与第二种算法SUPPA218（从转录本丰度而不是连接计数来估计剪接变化）进行了比较。SUPPA2从1482个基因中鉴定出2576个事件，两种方法之间的差异剪接基因有高度显著的重叠(补充图S2f)。
3、无论剪接体突变状态如何，pHGG中的1827个ASE都存在差异剪接。此外，随着突变剪接复合体成分的变化，pHGG剪接突变体中ASE可能性的增加(图1e和补充图。S1k).
4、差异剪接基因富集于RAS/MAPK、染色质、细胞通信和转运通路(图2b)中，经SUPPA2鉴定的结果非常相似(补充图S2g).
5、来自癌症体细胞突变图谱普查中的基因富集程度明显高于预期，有8%的基因在pHGG中差异剪接，特别是来自RAS/MAPK和染色质通路(补充图S3a, b)。此外，在TCGA来源的致癌通路中，RTK/RAS/MAPK和PI3K通路很大程度受剪接影响，而不受表达影响(补充图S3c).
6、癌症驱动基因中的大多数差异ASE被预测影响蛋白结构域、内在紊乱区域或PTMs（图2c、d）。总的来说，这些数据表明pHGG经常以非突变的方式激活致癌过程。因此，在个体样本和基因中，癌症驱动基因剪接的复发率都显著高于pHGG的突变(图2e)。
7、为了检验AS的频率以及癌症驱动因素是否是一个普遍的现象，作者发现在17个样本中，癌驱动剪接压力明显高于突变，并且比突变有更多的AS改变(图2f和补充图S3d, e).
8、成人弥漫性胶质瘤（胶质母细胞瘤，GBM；低级别胶质瘤；LGG）具有最高水平的剪接驱动改变（图2f，g）。差异较大的患者的总生存率(OS)明显较差(补充图S4a, b)。
9、IDH野生型GBM与IDH突变型弥漫性胶质瘤或没有相比预后较差，而GBM增加了癌症驱动相关AS(补充图S4c)。然而，癌症驱动因素AS对OS的影响是亚组独立的(补充图S4d)。IDH-wtGBM和IDH-mut/非codel星形细胞瘤的OS显著相关，IDH-mut/codel少突胶质细胞瘤有变化趋势(图2h，i和补充图S4e–i).
S4d-i：
10、使用剪接体抑制剂聚二烯内酯b检测HGG对剪接体的依赖性。包括正常人类星形胶质细胞在内的所有细胞系都对该药物非常敏感(图2j)。用第二种抑制剂也得到了类似的结果(补充图S4j)。表明HGG细胞对剪接体活性保持存活的基本要求。
图2j：
三、通过选择性剪接破坏染色质调节器的功能结果
1、在pHGG中，反复发生的H3K27M突变和DNA低甲基化会导致染色质破坏。我们的数据表明，AS也可能影响pHGG的表观遗传调控，染色质修饰物受剪接的影响大于表达变化(图2b和3a)。SWI/SNF、NuRD、PRC1.1等染色质调节因子受影响（图3b，c)。通过RT-PCR验证了MBD1和SMARCC1两个基因(补充图S2d)。有趣的是，SWI/SNF复合物先前参与了其靶基因的选择性剪接，这些靶基因在pHGG差异ASE中富集，与单个复合物成员的剪接显著相关(图3d，e)。
图2b、3a-e：
2、进一步分析差异ASE在染色质调节剂中的预测功能。大多数的AS涉及蛋白结构域、本质上无序的区域和/或PTMs，这表明染色质调节因子中的AS将影响其功能(图3f，g)
四、在HGG中通过NF1亚型激活RAS/MAPK信号
1、RTK/RAS/MAPK通路ASEs在HGG中显著富集。FGFR1、NTRK3、NF1和BRAF可能会影响RAS/MAPK的激活(图4a-d和补充图S5)。我们从一个小的独立的pHGG队列中验证了RNA-Seq中的FGFR1和NF1ASEs（补充图S5g，h）。
2、在RAS结合域的BRAF剪接(补充图S5a，b)被预测除去BRAF-S151，通过ERK磷酸化反馈限制RAS/MAPK的激活。NTRK3的剪接可以去除Y516的自磷酸化位点，这对RAS的激活很重要(补充图S5c, d)。因此，BRAF和NTRK3的剪接可以分别增加和减少MAPK的激活；然而，它们在pHGG中的差异表达与此相反(补充图S5b, d)。
3、FGFR1有两种亚型表达。FGFR1-β比FGFR1-α对FGF具有更高的亲和力，导致下游信号通路增加(补充图S5e, f)。
4、NF1外显子是pHGG中最显著的ASE之一(图4b-d)。NF1-II是主要的非脑亚型，而NF1-I在大脑中表达(补充图S5i)。NF1在pHGG中的整体表达没有变化(补充图S5j, k)。
5、最后，利用qRT-PCR进一步证实了NF1第23a外显子的差异剪接(补充图S5l)。同样，在三种小鼠pHGG模型中观察到了相同的亚型开关，这表明物种之间是保守的(补充图S5m)。
6、NF1-IDH突变的亚型在成年GBM中也很明显(图4e和补充图S6a)。尽管NF1分别在IDH-wt和IDH-mut/codel弥漫性胶质瘤中适度下调和上调，但该亚型与NF1的表达没有强烈的相关性(补充图S6b–e).
7、这些NF1外显子23a特异性形态促进了儿童和成人HGG细胞中23a外显子跳跃和激活MAPK信号通路(图5a和补充图S7a)。因此，NF1外显子23a高的成人弥漫性胶质瘤患者，磷酸化ERK显著升高（图5b）。此外，由RAS或MAPK转录调控的基因集，在pHGG和成人弥漫性胶质瘤中总体上调(图S7b-d)，在NF1外显子增加的肿瘤中显著上调，与NF1整体表达无关(图5c，d和补充图S7e–g)。相比之下，与RAS/MAPK突变的pHGG或成人弥漫性胶质瘤相关的RAS/MAPK激活没有增加(图5e，f补充图S7h)。
S7a-h
图5a-d：
8、排除NF1突变患者后，NF1-23a外显子增加在成人弥漫性胶质瘤中与更糟糕的OS相关(补充图S7i)。在多变量分析中与NF1表达和RAS/MAPK通路基因突变无关(图.5g，h和补充图S7j, k)。
S7i-k：
图5g-h：
9、建立了GBM35神经元分化模型，在没有血清的情况下，用丁酸钠培养细胞可以诱导分化(补充图S8a)。在该系统中，与未处理的细胞相比，U87GBM细胞表现出了强大的分化标记物诱导(补充图S8b)。与PC12细胞的神经元分化相比，NF123a外显子包涵体减少，而分化的U87细胞中NF123a外显子包涵体没有变化(补充图S8c)。NF1外显子不影响该系统和条件下HGG细胞的分化(补充图S8b)。
五、pHGG中NF1-23a外显子的选择性剪接由REST调控。
1、比较了包括剪接因子在内的差异表达基因，发现CELF和ELAVL家族成员是下调最多的基因，IGF2BP2/3在pHGG中上调，并伴随其结合基序的富集(图6a)。
2、CELF/ELAVL富集表明CELF/ELAVL家族抑制NF1第2a外显子23a内含物，而MBNL和TIA1/TIAL1家族促进其富集(补充图S9a、图6b和补充图S9a)。此外，CELF/ELAVL家族，特别是CELF3-5和ELAVL2-4家族表达下调，而TIA/TIAL1和MBNL3家族表达适度上调(图6c和补充图S9b).在成人弥漫性胶质瘤中也发现了同样的模式(补充图S9c–e)。
图6b-c：
S9a-e
3、通过RT-PCR证实了CELF4和ELAVL3抑制了NF1第23a外显子的包含，还验证了其他靶点，包括FGFR1 ASE(图6d)。
4、接下来比较了pHGG中CELF/ELAVL基因与NAS活性和NF123a外显子的表达，发现这些家族(特别是CELF3-6和ELAVL2-4)与NF123a外显子和RAS活性显著负相关(图6e)。
5、为了识别潜在调控因子，分析ChIP-Seq数据发现所有细胞系中几乎只有RE1沉默转录因子(REST；图7a)，通过ChIP-qPCR证实了三个原代pHGG细胞系中CELF3、CELF4和ELAVL3的相同位点(图7b和补充图S9g).
6、REST在pHGG中显著上调，含有RE1基序的REST结合基因的表达高度下调(图7c，d)。REST直接与大多数CELF/ELAV结合，并与它们的抑制呈负相关(图7e)。在原代pHGG细胞中敲除REST，发现CELF3、CELF4和ELAVL3的表达显著增加(图7f和补充图S9h)，REST缺失导致NF1-I表达显著增加，同时NF1-II的表达显著减少(图7g)。REST增加与NF1第23a外显子的剪接和RAS/MAPK的激活显著相关(图7h，i和补充图S9i)。总之，这支持了一种机制，即pHGG中REST的上调通过促进NF1第23a外显子来驱动RAS/MAPK信号通路的增加(补充图S9j).
总结：
本文中，作者通过多组学方法分析了儿童和成人HGG的选择性剪接过程，发现与正常大脑相比，剪接可能性增加了，且AS比点突变更频繁，并与HGG较差的预后相关。通过检查HGG中受选择性剪接影响的癌症途径来研究潜在的致癌性。在HGG中优先包含NF1第23a外显子会增加RAS/MAPK的活性，而不依赖于其RAS/MAPK含量的改变，NF1在超过80%的HGG中存在差异剪接，表明比单独突变更利于激活NF1介导的RAS/MAPK通路，降低胶质母细胞瘤患者的生存率。总的来说，我们的数据显示了另一种与临床相关的癌症致癌通路激活机制，这对于整合到未来的治疗工作流程中，以实现最佳的精准医疗非常重要。
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