美文网首页数量遗传或生统生信基础知识SSR开发
小麦misa+primer3设计SSR引物,并用e-PCR进行筛

小麦misa+primer3设计SSR引物,并用e-PCR进行筛

作者: dandanwu90 | 来源:发表于2019-08-23 10:28 被阅读0次

    1. 软件下载并安装

    #下载misa软件

    wget http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/download/misa.pl
    

    #下载配置文件

    wget http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/download/misa.ini
    

    #下载3个perl脚本

    wget http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/download/est_trimmer.pl
    wget http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/download/p3_in.pl
    wget http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/download/p3_out.pl
    
    

    # 搜索并安装primer3

    conda search primer3
    conda install -y primer3
    

    #下载e-PCR并安装

    wget http://ftp.debian.org/debian/pool/main/e/epcr/epcr_2.3.12-1.orig.tar.gz
    tar xvf epcr_2.3.12-1.orig.tar.gz
    cd e-PCR-2.3.12
    make -j 4
    echo 'PATH=$PATH:/home/wdd/biosoft/epcr/e-PCR-2.3.12/' >>~/.bashrc
    source ~/.bashrc 
     e-PCR --help
    

    2. 分析SSR

    准备要提取的序列的bed文件chr5D_part2.bed,对应的分别是fasta中的染色体号,起始位置,终止位置


    提取序列的bed
    bedtools getfasta -fi Chinese_Spring_v1.0.fasta -bed chr5D_part2.bed -fo chr5D_part2.fa
    

    #目标区段SSR分析

    perl misa.pl chr5D_part2.fa
    

    #提取SSR上下游各150bp的序列

    cat chr5D_part2.fa.misa |awk 'NR>1 {print $1"\t"$6-150"\t"$7+150}' >chr5D_part2_ssr.bed
    

    #使用bedtools工具提取重复序列

    bedtools getfasta -fi chr5D_part2.fa -bed chr5D_part2_ssr.bed -fo chr5D_part2_ssr.fa
    

    #再进行一次SSR查找

    perl misa.pl chr5D_part2_ssr.fa
    

    接下来就是修改p3_in.pl文件,这样使用它生成的文件就可以直接在primer3上面运行了,修改的内容可以参考primer3文件下的example文件,将p3_in.pl文件的输出内容和example的内容一致,我现在使用的版本的修改内容是:

    print OUT "PRIMER_SEQUENCE_ID=$id"."_$ssr_nr\nSEQUENCE=$seq\n";
    #改为
    print OUT "SEQUENCE_ID=$id"."_$ssr_nr\nSEQUENCE_TEMPLATE=$seq\n";
    
    perl p3_in.pl chr5D_part2_ssr.fa.misa 
    #然后使用primer3进行设计引物
    primer3_core --default_version=1 -- output=chr5D_part2_ssr.fa.p3out chr5D_part2_ssr.fa.p3in
    
    #primer3 引物结果输出文件整理
    perl p3_out.pl CS_2B_0M-80M_ssr.fa.p3out CS_2B_0M-80M_ssr.fa.misa
    

    3. e-PCR

    #提取输出文件中的第一对引物作为e-PCR的输入文件

    cat chr5D_part2_ssr.fa.results |awk 'NR>1 {print $1"\t"$8"\t"$11"\t"$1}' >chr5D_ssr.txt
    

    #e-PCR输出文件

    e-PCR  chr5D_ssr.txt D=100-500 ~/huxin/genome/Triticum_aestivum.IWGSC.dna.toplevel.fa N=2 G=2 T=3 > CS_2B_0M-chr5D_ssr_ePCR.txt
    

    4. R语言

    #筛查e_pcr的唯一结果

    setwd("C:\\Users\\Desktop\\")#切换目录
    data0<-read.table("~/Home/TTD_chr7A_ssr_ePCR.txt",sep="\t",header=F,full=T)
    data<-as.matrix(data0)
    dup<-unique(data[duplicated(data[,2]),2])
    num<-c()
    for (k in 1:length(dup)) {
    n<-which(data[,2]==dup[k])
    num<-c(num,n)
    }
    res0<-data[-num,]
    write.csv(res0,"chr5D_ssr_ePCR.csv",row.names=F)
    
    txt读入报错, 加入 参数full=T

    5. 在线检测

    将chr5D_ssr_ePCR.csv 与chr5D_part2_ssr.fa.results对应,提出第一对引物,在线检测

    小麦族多组学数据网站



    5.png

    相关文章

      网友评论

        本文标题:小麦misa+primer3设计SSR引物,并用e-PCR进行筛

        本文链接:https://www.haomeiwen.com/subject/vgfbrctx.html