Multiomics analyses and machine learning of nuclear receptor coactivator 6 reveal its essential role in hepatocellular carcinoma
核受体辅助因子6的多组学分析和机器学习揭示了其在肝细胞癌中的重要作用
发表期刊：Cancer Sci
发表日期：2022 Sep 10
影响因子：6.518
DOI: 10.1111/cas.15577
一、研究背景
原发性肝癌是全世界最致命的恶性肿瘤之一，其发病率近年来持续上升。肝细胞癌是PLC最常见的形式，约占PLC病例的90%。
核受体辅助因子6，又称NRC、AIB3、ASC2、PRIP、TRBP和RAP250，首次在人类乳腺肿瘤中发现，是众多核受体和转录因子的辅助因子。核受体辅助因子6能与多种核受体和一些转录因子相互作用并能促进其转录活性。此外，NCOA6也是一个名为ASCOM（代表ASC-2复合体）的类似Set1的复合体的一个整体和特定单位，它包含MLL3或MLL4并进行H3K4甲基化修饰。
二、材料与方法
1、数据来源
1）组织标本采集：在2010年11月至2020年11月期间在南方医科大学南方医院接受根治性切除术的HCC患者被纳入本研究
2）细胞系：人类HCC细胞系Hep3B和Huh-7
3）六个肝癌队列（TCGA-LIHC、ICGC-LIRI（日本）、HBV-HCC、GSE14520、GSE76427和GSE116174）
4）肝癌的蛋白质表达和临床信息从CPTAC获得
5）四个血清miRNA队列（GSE113740, GSE112264, GSE113486, GSE106817）：剔除重复样本后，收集了516份肝癌血清样本和4008份对照血清样本，包括3869份健康血清样本、46份慢性肝炎和93份肝硬化样本
2、分析流程
1）细胞转染、RNA分离和定量实时RT-PCR、免疫组化染色、细胞增殖试验、平板菌落形成试验、Transwell迁移和侵袭试验、Western blot分析
2）NCOA6的拷贝数改变、突变、DNA甲基化和磷酸位点的分析：使用cBioPortal确定TCGA泛癌患者中NCOA6的拷贝数改变和突变；肝癌的DNA甲基化数据从UCSC Xena下载；KM生存分析，以证明甲基化、磷酸位点和患者的临床结果之间的联系
3）基因组变异分析（GSEA）和基因组富集分析（GSVA）：研究NCOA6在肝癌中的潜在生物学过程
4）加权基因共表达网络分析和模块功能注释（WGCNA）
5）NCOA6表达与肿瘤微环境、免疫细胞浸润之间的关系：使用TIMER2数据库来探索NCOA6表达与巨噬细胞浸润之间的关系；使用ImmuCellAI平台计算TCGA-CIHC患者的免疫细胞浸润得分；TIDE
6）构建肝癌检测的诊断特征：使用 "limma "软件包从TCGA-CIHC miRNA数据中计算出肝癌和正常组织之间差异表达的miRNAs；在NCOA6相关的miRNA和差异表达的miRNA之间选择相同的miRNA来开发血清诊断特征；将血清样本按8:2的比例分为训练组和内部验证组；LASSO、用10倍交叉验证对二元样本（肝癌与非癌症对照）进行分类
流程图
三、实验结果
01 - 生物信息分析证明NCOA6的高表达是HCC的一个预后危险因素
利用TCGA数据库进行分析，探讨NCOA6基因在泛癌中的表达。结果显示，NCOA6的mRNA在大多数癌症中明显高于相关正常组织，包括胆管癌和肝脏HCC，其相关正常组织的NCOA6 mRNA表达量最低（图1A）。为了验证NCAO6在肝脏的低表达，对GTEx数据库进行了分析，结果表明，与其他器官相比，NCOA6在肝脏的表达水平最低（图1B）。接下来，基于TCGA数据库进行单变量Cox回归分析，研究NACOA6表达与癌症患者预后的关系。结果表明，NCOA6的高表达是HCC、嗜铬细胞瘤或副神经节瘤患者OS时间短的一个风险因素（图1C）。NCOA6在肝脏和HCC中表达的明显差异（图1D,E）及其在预后预测中的临床意义表明，NCOA6可能在促进HCC中发挥重要作用。
为了进一步研究NCOA6和HCC之间的关系，基于TCGA数据库分析了NCOA6表达的HCC的临床特征。NCOA6的表达与HCC的TNM分期和差异等级密切相关。具体来说，NCOA6在TNM分期III/IV组比TNM分期I/II组有更高的表达（图1F），NCOA6在分化不良的HCC样本中的表达也明显高于分化良好的样本（图1G）。此外，NCOA6在TNM分类的T 3/4期中的表达明显高于T 1/2期组（图1H），并且有一个趋势，即有淋巴结浸润的HCC样本比没有淋巴结浸润的样本有更高的NCOA6表达（图1I）。然而，这种趋势在远处转移的特征中没有看到，这可能是由于TCGA数据库中远处转移的HCC患者的样本量较小（图1J）。这些结果表明，NCOA6可能促进HCC的发展和转移。
图1 NCOA6在泛癌中的mRNA表达及其与临床癌症特征的关系
为了全面探讨NCOA6在HCC中的预后价值，作者使用三个mRNA测序数据库（TCGA-HCC、ICGC-HCC和HBV-HCC队列）进行KM分析。结果证实，HCC样本中NCOA6高表达的患者的OS明显短于NCOA6低表达的患者（图2A-C）。此外，对TCGA数据库中HCC患者的NCOA6与其他临床参数的单变量和多变量Cox回归分析显示，NCOA6的高表达是HCC患者的一个独立预后危险因素（图2D,E）。为了验证NCOA6的预后价值，将上述三个mRNA测序队列与另外三个来自GEO数据库的ChIP测序数据集（GSE116174、GSE14520和GSE76427）结合起来，用 "meta "R软件包进行元分析。如图2F所示，集合危险比为1.53，六个数据集之间的异质性较小。因此，NCOA6作为一个预后因素，可以显著影响HCC患者的预后。
图2 NCOA6的表达水平与HCC患者的总生存期的关系
为了进一步验证这些结果，使用临床HCC样本进行分析。如图3A,B所示，85%的HCC样本（20例）中NCOA6的mRNA表达明显高于邻近的正常肝组织。此外，对15对HCC样本和邻近肝组织的免疫组化分析证实，NCOA6在肿瘤组织中明显高表达（图3C，D）。此外， HCC标本库的KM分析（图3E）、单变量（图3F）和多变量（图3G）Cox回归分析表明，NCOA6高表达的患者在治愈性肝切除后的无瘤生存时间比NCOA6低表达的患者短，而且NCOA6高表达是无瘤生存时间的独立危险因素。这些结果与上述分析一致，强调了NCOA6在HCC预后中的重要性。
图3 NCOA6在HCC样本中的表达及其预后价值
02 - 调控NCOA6表达的基因和表观遗传学改变
为了进一步探讨NCOA6对HCC细胞的影响，作者通过siRNA成功构建了NCOA6低表达的HCC细胞模型（图4A）。如图4B,C所示，NCOA6在Hep3B和Huh-7细胞中的敲除表达明显抑制了HCC细胞的增殖。此外，迁移（图4D）和侵袭（图4E）实验表明，在Hep3b和Huh-7细胞中，低NCOA6表达的HCC细胞通过基底膜的数量明显低于阴性对照。接下来，检测了EMT标志物的蛋白水平。结果显示，NCOA6的耗竭下调了N-cadherin和vimentin的表达，增加了E-cadherin的表达，这表明NCOA6的耗竭损害了HCC的EMT。
图4 NCOA6对HCC细胞的增殖、迁移和侵袭的影响
上述分析揭示了NCOA6在HCC中的重要作用。然而，NCOA6在HCC中表达异常的原因仍不清楚。为了研究NCOA6失调的潜在机制，利用TCGA数据库分析了HCC的基因和表观遗传学改变。如图5A所示，NCOA6的基因突变在各种组织中很常见，大约2.7%的HCC病例出现了基因突变。还检查了HCC患者中NCOA6的体细胞CNVs。如图5B所示，CNV增益是主要的改变，该组的NCOA6表达明显高于正常组（二倍体组）。
DNA甲基化是调节基因表达的一个重要机制。因此，我们进一步分析了NCOA6的甲基化水平。结果显示，与其他四个甲基化位点相比，有两个甲基化位点（cg16161156和cg17129400）被显著甲基化，而且cg16161156上的甲基化水平远远高于其他五个位点（图5C）。相关分析意味着NCOA6的表达与总的基因甲基化水平呈负相关（图5D），它也与cg16161156和cg17129400上的基因甲基化水平分别负相关（图5E）。此外，对这两个位点的甲基化水平进行生存分析发现，这两个位点甲基化水平低的患者预后较差（图5F），这一结果证实NCOA6的基因甲基化可以影响NCOA6在HCC中的功能。上述分析明确了CNV改变和DNA甲基化是导致NCOA6在HCC中表达失调的两个部分原因。
图5 TCGA数据库中遗传和表观遗传改变对NCOA6表达的影响
03 - 分析NCOA6在转录和翻译水平的潜在下游机制
作者使用了一个在线工具PhosphoSitePlus，结果显示NCOA6蛋白中有各种潜在的磷酸化位点（图6A）。接下来，分析了以前公开的HCC患者NCOA6蛋白的磷酸化信息（数据来自Gao等人的报告）。结果表明，检测到六个特定的磷酸化位点，并且这些位点的磷酸化水平在邻近的肝脏和HCC组织之间存在明显的失调（图6B）。具体来说，HCC组织中S1325、S1343、S2018和S1809的磷酸化水平明显高于邻近的肝脏组织。然而，邻近肝组织中S1481和S2043的磷酸化水平明显高于HCC中的水平。此外，分析了NCOA6蛋白磷酸化对HCC患者预后的影响。结果显示，在S1325、S1481、S2018和S1809有较高磷酸化水平的患者比在这些位点有较低磷酸化水平的患者的生存概率更差（图6C）。这一结果意味着这些蛋白位点的磷酸化可能调节NCOA6的功能，并为开发抗HCC药物提供一个潜在的目标。
图6 HCC中NCOA6蛋白的磷酸化分析
为了确定NCOA6影响HCC发展的潜在下游机制，作者首先分析了TCGA数据库中HCC的转化数据。基于癌症标志通路基因集的GSVA富集分析显示，NCOA6高表达的HCC富集在NOTCH/TGF-β/WNT/PI3K/MYC信号通路和细胞周期。相反，NCOA6低表达的HCC富集于代谢相关途径，包括异物、胆汁酸和脂肪酸的代谢（图7A）。此外，使用基于京都基因和基因组百科全书的基因集的GSEA富集方法来分析TCGA数据库中HCC的转化数据。结果表明，NCOA6高表达的HCC在缝隙连接、IL-17信号通路、mTOR信号通路、p53信号通路、PD-L1表达和PD-1检查点通路以及Th1和Th2细胞分化方面也有富集（图7B）。
为了证实下游分析的结果，利用CPTAC数据库中HCC的翻译数据来探索NCOA6的潜在下游机制。利用HCC蛋白谱进行加权基因共表达网络分析，建立无标度共表达网络。共产生了13个蛋白模块（图7C，D）。在这些基因模块中，MEgreen模块与NCOA6的表达显示出最高的相关性，被认为是 "NCOA6相关的蛋白质模块"（它包含361个蛋白质）。该蛋白模块与HCC患者的总生存期呈显著负相关，与HCC血栓呈正相关，这表明NCOA6相关蛋白模块与HCC的预后和转移有关（图7E）。此外，利用Metascape对NCOA6相关蛋白模块进行了丰富的生物通路分析，结果证实了上述转录数据的结果。如图7F所示，该蛋白模块的功能在TGF-β信号通路、EMT、伤口愈合和细胞周期中富集，在mRNA加工和剪接中也富集。
图7 NCOA6在转录和翻译水平上的下游分析
04 - NCOA6的表达与HCC的免疫浸润有关
上述分析指出，NCOA6高表达的HCC在IL-17信号通路、PD-L1表达和PD-1检查点通路、Th1和Th2细胞分化中富集，表明NCOA6与免疫微环境的潜在关系。为了验证这一假设，首先使用在线工具TIMER 2.0来探索NCOA6在HCC中的影响。如图8A所示，NCOA6的表达与肿瘤纯度和MDSCs、Tregs和M2巨噬细胞的免疫浸润明显呈正相关。为了验证这一结果，使用ImmuCellAI平台计算了TCGA数据库中不同免疫细胞在HCC中的浸润情况，并使用Pearson相关分析计算了与NCOA6的关系。结果显示，NCOA6与CD4幼稚T细胞、CD8幼稚T细胞和Tregs的浸润呈明显正相关，与自然杀伤细胞和CD8 T细胞的浸润呈明显负相关（图8B）。在HCC中进行了基因共表达分析，以探索NCOA6表达与免疫抑制基因之间的关系。结果发现，除了KIR2DL1和LAG，NCOA6的表达与大多数免疫抑制基因呈正相关。这些结果强烈表明，NCOA6的高表达与HCC的免疫抑制环境有关。TIDE是对合适人选进行免疫检查点阻断治疗的预测指标，被广泛使用并强烈推荐用于评估免疫反应。因此，我进一步分析了TIDE评分和NCOA6表达之间的相关性。结果显示，NCOA6的表达与TIDE评分、MDSC浸润和排除性免疫亚型呈明显的正相关（图8D,E），与上述结果一致。
图8 TCGA中NCOA6的表达与肝细胞癌的免疫浸润之间的分析
05 - 核受体辅助因子6相关的血清miRNA签名对HCC检测显示出很高的诊断价值
为了提高NCOA6在HCC中的临床检测价值，作者利用机器学习算法建立了NCOA6相关的血清miRNA特征。首先，在TCGA-HCC队列中使用Spearman相关分析，发现了108个与NCOA6表达密切相关的miRNA；在TCGA-HCC队列中使用 "limma "R软件包来识别NCOA6高组和低组之间的DEGs，发现了300个DEGs。在这两部分miRNA的交叉点上有42个miRNA，这42个基因被命名为NCOA6相关miRNA（图9A）。使用LASSO方法得到39个候选的NCOA6相关miRNAs，建立了HCC检测的血清诊断特征（图9B-D）。
来自HCC患者和非癌症对照组的具有miRNA表达数据的血清样本（HCC=516；非癌症对照组=4008）按8：2的比例随机分成两个队列（训练队列和验证队列）。在LASSO回归和机器训练之前，用SMOTE算法解决训练队列中存在的不平衡类问题，得到SMOTE改进的训练队列。然后，使用支持向量机算法在SMOTE-改良的训练队列中，通过10倍交叉验证，构建了一个用于HCC检测的诊断特征（命名为NCOA6-miRNAs特征）（图9E）。NCOA6-miRNA签名在区分SMOTE-ameliorated训练队列中的HCC样本和非癌症对照组方面显示出很高的诊断能力，AUC为0.999，F1得分为0.989，平衡准确度为0.990（图9F）。
为了进一步验证NCOA6 miRNA签名的HCC检测价值，将其应用于原始训练、验证和联合队列。结果显示NCOA6 miRNA特征的诊断价值令人满意，在训练（图9G）、验证（图9H）和合并队列（图9I）中的AUC值分别为0.996、0.962和0.991。这三个队列的F1得分分别为0.935、0.717和0.895；这三个队列的平衡精度分别为0.982、0.830和0.951。为了揭示患者性别和年龄对NCOA6 miRNA签名的诊断效果的影响，对不同性别的m6A miRNA签名的输出强度进行了研究，男性和女性组之间没有明显差异；此外，患者年龄与NCOA6 miRNA输出强度之间没有明显的相关性（图9J,K）。这些结果表明，NCOA6 miRNA特征是区分HCC和对照组的独立生物标志物，不受患者性别和年龄的影响。相反，考虑到乙肝和丙肝病毒感染引起的肝硬化是HCC的主要原因之一，这往往会干扰HCC的诊断，作者研究了NCOA6 miRNA签名区分HCC患者与慢性肝炎和肝硬化患者的能力。发现NCOA6 miRNA签名的输出强度的值范围在HCC或肝炎/肝硬化患者之间只有很小的重叠（图9L），AUC为0.990，F1得分为0.956，平衡准确率为0.949（图9M）。上述结果表明，NCOA6 miRNA签名的诊断性能可能不受肝硬化的影响。
图9 利用机器学习算法建立NACO6相关的血清miRNA特征，用于HCC诊断
四、结论
在这项研究中，揭示了NCOA6在HCC中的预后价值，并证实了它对HCC增殖、迁移和侵袭的调控。多组学和免疫浸润分析揭示了NCOA6促进HCC的潜在机制。基于NCOA6相关的miRNAs，利用机器学习算法建立了一个miRNA签名，该签名在检测HCC方面表现强大。
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