Integrated analysis of transcriptomics, proteomics and metabolomics data reveals the role of SLC39A1 in renal cell carcinoma
转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据的综合分析揭示了SLC39A1在肾细胞癌中的作用
发表期刊：Front Cell Dev Biol
发表日期：2022 Nov 3
影响因子：6.081
DOI: 10.3389/fcell.2022.977960
一、研究背景
肾细胞癌（RCC）是最普遍的肾脏恶性肿瘤，在2021年所有估计的癌症病例中排名第八。对致癌分子机制的模糊认识和转移后对化放疗的不敏感，导致RCC患者的临床管理效率低下。
最近，越来越多的证据表明，肿瘤的发生与代谢途径的错综复杂的变化之间的关系，这就是所谓的代谢重编程。Warburg效应是肿瘤代谢重编程的一个新标志，指的是无论线粒体是否正常和氧气是否充足，肿瘤细胞都容易增加葡萄糖的吸收并促进其转化为乳酸的现象。癌细胞中的糖酵解开关允许糖酵解中间代谢物参与体内核苷酸和氨基酸的合成，因此，维持了肿瘤的长期生长、增殖和生存。
SLC39A1，也被称为ZIP1，负责将锌离子转移到细胞中。在ZIP家族中有14个蛋白成员。ZIP蛋白中有8个跨膜结构域，锌的转运被认为与位于结构域III和IV之间的细胞内环有关。
二、材料与方法
1、数据来源
OSRC-2细胞
2、分析流程
1） 细胞培养、细胞转染、Western blotting检测、RNA提取和定量实时PCR检测
2） 转录组学分析：RNA提取和RNA检测；用Illumina HiSeq高通量测序平台对cDNA文库进行测序；用DESeq筛选差异表达基因（DEGs）；使用R语言Pheatmap软件包对样本的所有不同基因进行双向聚类分析；根据不同样品中同一基因的表达水平和同一样品中不同基因的表达模式，用欧氏方法计算距离，用完全连锁法进行聚类；使用疾病本体论（DO）和DisGeNET数据库来发现有DEGs改变的人类疾病
3） 蛋白质组学分析：样品制备；LC-MS/MS分析
4） 代谢组学分析：样品制备和提取；T3 UPLC；QTOF-MS/MS；ESI-Q；MS/MS的质量控制；代谢物的定性和定量；PCA、层次聚类分析和Pearson相关系数 PCA（主成分分析）由R（www.r-project.org）内的统计函数prcomp进行；差异性代谢物的选择
5） 通过Cytoscape构建基因、蛋白质和代谢化合物的网络，以确定DEGs显著富集的路径，并揭示基因和代谢物之间的潜在调控机制
6） 统计分析和生物信息学分析：GO、KEGG和COG数据库被用于蛋白质功能注释；InterPro数据库和MultiLoc2分别用于领域注释和亚细胞定位分析；KEGG、GO和Reactome数据库显示了参与差异基因的信号转导途径；DO和DisGeNET数据库被用来揭示与差异基因相关的人类疾病；HMDB数据库提出了由差异性代谢物富集的人类代谢、代谢性疾病途径、代谢物信号传导和药物活性途径；MESA分析使用来自MebaboAnalyst的代谢物数据库进行
三、实验结果
01 - SLC39A1-过表达的OSRC-2肾癌细胞的转录组学分析结果
两组OSRC-2细胞（NC和ZIP）分别转染了空载体和SLC39A1载体。然后进行rt-PCR检测和Western blot检测以测试转染效率。SLC39A1过表达后有321个DEGs，其中71个上调，250个下调（图1A）。使用KEGG数据库来解释受DEGs影响的具体分子功能。总共发现16条KEGG途径被富集，包括烟酸和烟酰胺代谢、补体和凝血级联、中性粒细胞胞外陷阱形成、谷胱甘肽代谢、金黄色葡萄球菌感染等。随后，通过将DEGs与GO数据库中的三个功能词进行映射，将可能受SLC39A1调控的基因映射到生物过程（BP）中，分别为细胞外结构组织、多细胞机体平衡、氨基酸跨质膜导入、细胞基质组织和伤口愈合；细胞成分（CC）为细胞基质、细胞顶端部分、基底质膜和顶端质膜；分子功能（MF）为肽结合（图1B）。此外，Reactome数据库整合了各种反应和生物途径，结果显示了纤维蛋白凝块形成、胶原蛋白降解和整合素细胞表面相互作用方面的突出变化（图1C）。DO数据库能够提供与人类基因功能和疾病有关的数据，DisGeNET数据库整合了与人类疾病有关的基因。SLC39A1引发了与泌尿系统和肾脏疾病、肺部疾病、动脉硬化和胃癌有关的基因的明显改变（图1D）。此外，DisGeNET分析结果表明，SLC39A1在与补体因子I（C3失活剂）缺乏、缺血性中风、绒毛膜癌和高血压病有关的基因中引起了显著的变化。此外，在差异表达的基因中，还发现了SLC39A1的一个已知的相互作用蛋白。亲和捕获MS证实，被SLC39A1显著下调的补全C5a受体1(complete C5a receiver 1, C5AR1)与SLC39A1直接相互作用
图1 SLC39A1-过表达的OSRC-2细胞的转录组学分析
02 - SLC39A1过表达的OSRC-2肾癌细胞的蛋白质组学分析结果
火山图综合显示了2组之间蛋白质表达水平的明显差异，共鉴定了324个蛋白质，其中124个上调，200个下调（补充图S3A）。KEGG富集分析显示了信号转导途径和代谢过程的改变，其中涉及不同的蛋白质。气泡图显示了PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路、补体和凝血级联以及铁蛋白的明显富集（图2A）。在GO富集分析中，差异蛋白被映射到GO数据库中的三个术语，以定义它们的主要生物学功能。饼状图显示，SLC39A1可能调节的生物过程（BP）包括但不限于：对无机物的反应、蛋白酶体泛素无关的蛋白质分解过程、上皮细胞的形态发生（图2B）。SLC39A1还代表了对分子功能（MF）的重大影响，如信号受体结合、氧化还原酶活性、辅助因子结合、细胞外基质结构成分（图2C）。此外，SLC39A1可能有助于细胞成分（CC）的形成，包括分泌颗粒和囊泡、含胶原的细胞外基质和蛋白酶体复合物（图2D）。正统蛋白质群（COG/KOG）富集分析显示SLC39A1与OSRC-2细胞中的核苷酸运输和代谢、代谢细胞外结构和无机离子运输有关（图2E）。两组之间的差异可能是源于不同结构域的功能或定位。亚细胞定位分析明确了差异蛋白的具体细胞定位，这与蛋白的功能密切相关。差异蛋白主要分布在细胞质、核和ER（补充图S3B）。而结构域富集分析显示，差异蛋白的结构域主要包含蛋白酶体亚单位A/B和EGF样结构域（补充图S3C）。
图2 SLC39A1-过表达的OSRC-2细胞的蛋白质组学分析
补充图S3
03 - SLC39A1-过表达的OSRC-2肾癌细胞的代谢组学分析结果
对RCC细胞样本的代谢组学数据进行了分析，以评估其代谢差异。主成分分析（PCA）和正交部分最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）显示了两组之间的综合代谢变化。PCA（图3A）和OPLS-DA（图3B）的得分图见证了明显的分离，表明SLC39A1对RCC的代谢造成了明显的干扰。60个重要的差异性代谢物被过滤出来，根据KEGG数据库对差异代谢物的功能注释，按照KEGG途径类型进行分类，发现多种代谢变异：嘌呤代谢、嘧啶代谢、半乳糖代谢、谷胱甘肽代谢和cAMP信号途径（图3C）。MSEA富集分析能够防止遗漏具有重要生物学意义的不明显的差异表达代谢物。分析表明，SLC39A1在MSEA中引发了50多个代谢组的改变（图3D）。此外，人类代谢组数据库（HMDB）的富集分析显示，SLC39A1还对精氨酸和精胺的生物合成、乳糖的生物合成、GLUT-1缺陷综合征和先天性糖基化障碍CDG IId具有明显的影响（图3E）。然后选择涉及不少于5个差异性代谢物的途径进行聚类分析。热图显示SLC39A1调节的代谢物被聚类在核苷酸及其代谢组、糖及其衍生物、小肽和有机酸中（图4A）。
图3 SLC39A1-过表达的OSRC-2细胞的代谢分析
04 - 综合蛋白质组学、转录组学和代谢组学数据
转录组学和蛋白质组学数据描述了蛋白质和基因之间的关系。维恩图表明，共有8个蛋白质在mRNA和蛋白质水平上有差异表达。热图显示了8个蛋白质的调节类型之间的对应关系（图4B）。
图4 SLC39A1-过表达的OSRC-2细胞的综合分析
基于蛋白质组学、转录组学和代谢组学数据的综合分析解释了不同表达的代谢物和基因之间的潜在相关性。通过将差异基因和代谢物映射到KEGG途径上进行富集分析。SLC39A1引起了肾癌细胞代谢途径的明显紊乱，改变了71个基因的转录和翻译水平。几种物质的代谢受到明显影响：嘌呤代谢、嘧啶代谢、多种氨基酸代谢、乳糖代谢和游离脂肪酸代谢。综合数据分析表明，SLC39A1丰度的增加引起了明显的代谢重编程。
在核苷酸代谢中，观察到尿苷、UMP的明显下调，以及2′-脱氧肌苷的上调（图5A）。相应地，嘧啶和嘌呤代谢中的酶也发生了变化：磷酸二酯酶2A（PDE2A）、腺苷酸激酶6（AK6）、二氢嘧啶脱氢酶（DPYD）、脱氧胞苷激酶（DCK）表达减少，鸟苷酸环化酶1可溶性亚单位α1（GUCY1A1/GCYA1）增加（图5B）。半乳糖的代谢也发生了转变，其中乳糖和乳木糖减少（图5A）。醛酮还原酶家族1成员B（AKR1B1）和半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶（GALT）被消耗，半乳糖变异酶（GALM）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC）被激活（图5B）。在氨基酸和肽的代谢方面，SLC39A1减少了RCC细胞中的蛋氨酸，并降低了半胱氨酸γ-解酶（CTH）的水平（图5A）。SLC39A1也参与了GSH代谢，减少了精氨酸的产生（图5A）。SLC39A1下调CHAC1（γ-GCTs，谷胱甘肽特异性降解酶）和异柠檬酸脱氢酶样蛋白（IDHP），同时促进N-乙酰转移酶8（NAT8）（图5B）。在脂质代谢方面，SLC39A1明显增加了游离脂肪酸（图5A），硬脂酰-CoA去饱和酶（SCD）表达水平增加（图5B）。
SLC39A1已被证明可以调节与肿瘤发生和发展密切相关的信号转导途径中的关键基因，涉及PI3K-AKT信号途径、cAMP信号途径、PPAR信号途径和铁中毒。在PI3K-AKT途径中，SLC39A1减少了成熟T细胞增殖1（MTCP1），下调了AKT下游因子：cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（CDN1B），但上调了I-κB激酶β（IKKβ）。在cAMP信号途径中，钙/钙蛋白依赖性蛋白激酶II伽马（CaMK）活性被激活。由cAMP直接激活的交换蛋白（Epac）和PKA表达被上调。在PPAR信号途径中，脂肪酸结合蛋白（FABP）、SCD和酰基-CoA合成酶长链（ACSL）被上调，而血管生成素样4（ANGPTL4）、周脂素2（PLIN2）和酰基-CoA氧化酶（ACOX）的表达降低。此外，SLC39A1对铁中毒相关因素也有重要的调节作用：溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、核受体辅助因子4（NCOA4）、血红素氧合酶1（HO-1）和铁蛋白的表达减少，而阿凯特-斯库特家族bHLH转录因子4（ASCL4）和脑浆蛋白（CP）的表达被激活（图5C）。
图5 代谢和信号途径中的代谢物和基因改变的综合分析结果
为了更直观地展示差异基因、蛋白质和差异代谢物之间的联系，用Cytoscape描绘了一个相关网络（图6）。差异基因和蛋白质在嘌呤和嘧啶代谢、乳糖代谢以及谷胱甘肽和蛋氨酸代谢中引起了明显的干扰。酶（如PDE2A、DPYD、DCK、AKR1B1、CHAC1、CTH等）的mRNA或蛋白水平的变化引发了几种代谢物的改变：尿苷、脱氧肌苷、精氨酸、蛋氨酸、乳糖，这与上述结果一致。
图6 差异性表达基因、蛋白质和差异性代谢物之间的相互作用网络图
四、结论
本研究表明，SLC39A1在RCC中发挥着肿瘤抑制因子的作用。综合转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据表明，SLC39A1的抗肿瘤作用可能与嘌呤和嘧啶代谢、谷胱甘肽代谢和铁中毒、ROS的产生、PI3K-AKT、cCAMP-Epac和PPAR信号途径的改变有关。然而，在SLC39A1抑制肿瘤进展的过程中，Zn2+是否是一个不可缺少的中间环节仍有待探讨。
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