最近看到Fly Cell Atlas (FCA) 公布果蝇的多个组织的单细胞核转录组测序数据，虽然FCA组织提供了多个在线平台（例如SCope）进行非常方便的可视化和多种分析。然而，由于网速的原因，还是希望将数据下载到本地进行分析。
Figure Source: SCope (https://scope.aertslab.org/#/FlyCellAtlas/)
FCA提供了.loom 和 .h5ad格式的数据，而我比较习惯使用R的Seurat处理单细胞的数据，便想看看有没有方法将这两种格式的文件转换成Seurat对象。
实际上，Seurat也开发了SeuratDisk这一软件包支持将.loom转换为Seurat对象（还支持多种单细胞数据格式的转换）。
不巧的是，FCA的数据存储格式似乎与Seurat设置的格式不一致，导致简单的数据转换变得十分复杂...因此，本文记录我在转换.loom/.h5ad为Seurat对象时踩过的坑。
数据下载
FCA的测序数据都可以在该网站下载：https://flycellatlas.org/
我这篇文章先尝试了使用果蝇头部的数据进行转换
Figure Source: Fly Cell Atlas (https://flycellatlas.org/)
loom 文件
.loom格式是一种用于处理大型单细胞数据的文件格式，它并不直接将单细胞数据读入（R中），而是与文件创建链接。这样可以只在使用到数据时，读入其中的一部分，避免内存的过度占用（个人理解）。
Figure Source: Loompy (http://linnarssonlab.org/loompy/index.html)
FCA 中使用的是3.0.0版本的loom，以下我只对这个版本的格式进行介绍。
.loom实质上是基于HDF5 (Hierarchical Data Format)格式的。所以，我们可以使用HDFView 这种查看HDF格式的软件观察其中的数据格式。
HDFView可在https://www.hdfgroup.org/downloads/hdf5/ 下载
邮箱注册之后选择相应系统版本下载就行。
loom v3的文件包含了以下几个层级的数据：
-
/matrix(must): 基因*细胞的矩阵 -
/attrs(must): 全局的属性信息，例如使用的参考基因组、数据创建日期等信息 -
/col_attrs(must): 列（细胞）的属性，例如barcode, cell id, cell annotation
-
/row_attrs(must): 行（基因）的属性，包括基因ID，细胞marker之类的
-
/layers(optional): 另外的基因*细胞矩阵，例如可以保存Seurat的data以及scale.data -
/col_graphs(optional): 细胞的图信息，例如最近邻图（nearest-neighbor graphs） -
/row_graphs(optional): 基因的图信息
loom to Seurat
简单了解loom文件格式后，我们就可以在R中着手将其转换为Seurat对象
SeuratDisk提供了在R中处理 loom v3文件所需的函数。
目前SeuratDisk还只能安装其Github上的版本
remotes::install_github(repo = 'mojaveazure/seurat-disk', ref = 'develop')
创建loom链接
library(SeuratDisk)
library(SeuratObject)
library(Seurat)
# Connect to the file
# Loom v3 standards
ds <- Connect(filename = "data/ref/s_fca_biohub_head_10x.loom", mode = "r") # r for read-only and r+ for read/write
> ds
Class: loom
Filename: ~\data\ref\s_fca_biohub_head_10x.loom
Access type: H5F_ACC_RDONLY
Attributes: last_modified
Listing:
name obj_type dataset.dims dataset.type_class
attrs H5I_GROUP <NA> <NA>
col_attrs H5I_GROUP <NA> <NA>
col_graphs H5I_GROUP <NA> <NA>
layers H5I_GROUP <NA> <NA>
matrix H5I_DATASET 100527 x 13056 H5T_FLOAT
row_attrs H5I_GROUP <NA> <NA>
row_graphs H5I_GROUP <NA> <NA>
访问loom中的数据
可以通过[[的方法访问loom文件中的数据，注意到我们是通过一种路径的方式来访问其中的数据
# gene * cell matrix
> ds[["/matrix"]]
Class: H5D
Dataset: /matrix
Filename: ~\data\ref\s_fca_biohub_head_10x.loom
Access type: H5F_ACC_RDONLY
Datatype: H5T_IEEE_F32LE
Space: Type=Simple Dims=100527 x 13056 Maxdims=Inf x 13056
Chunk: 64 x 64
> ds[["/matrix"]][1:3,1:3]
[,1] [,2] [,3]
[1,] 0 7 19
[2,] 0 1 2
[3,] 0 1 4
> ds[["/matrix"]]$dims
[1] 100527 13056
# cell annotation
> ds[["/col_attrs/annotation"]][1:3]
[1] "unannotated" "unannotated" "lamina wide-field 2 neuron"
在R中，HDF5格式的文件被转换为H5D类的对象，类似于R6对象，H5D也定义了一系列的方法
> ds[['/matrix']]$methods()
<H5D>
Inherits from: <H5RefClass>
Public:
attr_delete: function (attr_name)
attr_delete_by_idx: function (n, obj_name, idx_type = h5const$H5_INDEX_NAME, order = h5const$H5_ITER_NATIVE,
...
Private:
closeFun: function (id)
get_robj_dim: function (reg_eval_res)
pid: environment
pmessage:
stopOnInvalid: function (error.msg = "The object is invalid")
由于我没有深入去探究
H5D类的各种方法是如何调用，这里就不做展开了，有兴趣的朋友可以查看Rhdf5r包的文档：https://www.rdocumentation.org/packages/hdf5r/versions/1.3.3/topics/H5D-class
Converting from loom to seurat
接下来，我尝试通过Seurat::as.Seurat()将loom格式转换为Seurat对象。但在运行几个步骤后就报错了...
> fca_head_seurat <- as.Seurat(ds)
# Reading in /matrix
# Storing /matrix as counts
# Saving /matrix to assay 'RNA'
# Error in `[<-.data.frame`(`*tmp*`, names.intersect, i[index], value = c(`128up` = 0, :
# missing values are not allowed in subscripted assignments of data frames
搜索该报错，可以找到seurat github上的一个issue有讨论这种错误。
https://github.com/satijalab/seurat/issues/5124
大意是FCA存储loom文件的格式跟Seurat识别的格式不太一样，所以就报错了。目前这种格式对应的问题还没解决，只能通过使用H5AD格式的文件转换为Seurat对象来绕过这个问题。
H5AD
H5AD 也是一种HDF5格式的文件，其中包含额外的AnnData
Figure Source: AnnData (https://anndata.readthedocs.io/en/latest/)
这里不再过多介绍
H5AD，我们大概知道它也是用于存储单细胞数据就可以了，有兴趣的朋友可以自行了解：https://anndata.readthedocs.io/en/latest/
Converting h5ad to seurat
接下来，我们将H5AD转换为h5seurat格式，再读入R中就是Seurat对象了
library(Seurat)
library(SeuratData)
library(SeuratDisk)
# Converting from AnnData to Seurat via h5Seurat
Convert("data/ref/s_fca_biohub_head_10x.h5ad", dest="h5seurat", overwrite=T)
fca_head <- LoadH5Seurat("data/ref/s_fca_biohub_head_10x.h5seurat")
> fca_head
An object of class Seurat
1838 features across 100527 samples within 1 assay
Active assay: RNA (1838 features, 0 variable features)
3 dimensional reductions calculated: pca, tsne, umap
这次转换成功了，我们获得Seurat对象 😃
但是，注意到h5ad转换过来的对象只有1838个基因，而不是loom文件中的13056个。有可能是因为这个数据中的基因是经过一定过滤的。
读入的这个对象居然有10.1 GB这么大，难怪他们会用loom/h5ad的文件格式来进行分析
在读入数据后，事情也还没结束。因为我们需要的是它的细胞注释信息。但是读入的数据结构中，有关细胞信息的meta.data居然是空的。
> fca_head@meta.data
data frame with 0 columns and 100527 rows
仔细观察其数据结构发现，相关的注释信息都存储在fca_head@misc当中，但问题在于找不到一个注释数据与细胞ID是匹配的。换言之，我也不能借助h5ad这组数据获得细胞注释。
Create seurat object
在转换的办法行不通后，自然想到直接使用loom文件和h5ad文件中的数据构建seurat对象.
首先，提取loom文件中的基因 X 细胞矩阵，注意将其转换为稀疏矩阵（节省空间）。由于提取出的矩阵是细胞 X 基因的形式，故对其转置
library(tidyverse)
library(SeuratDisk)
library(SeuratObject)
library(Seurat)
# gene * cell matrix
fca_head_mat <- ds[["/matrix"]][,]
fca_head_mat <- Matrix::Matrix(fca_head_mat, sparse=T)
fca_head_mat <- Matrix::t(fca_head_mat)
接着，提取cell id and gene id，并设置为矩阵的列名和行名
# cell id -- 100,527
fca_head_cellid <- ds[["/col_attrs/CellID"]][]
# gene -- 13,056
fca_head_geneid <- ds[["/row_attrs/Gene"]][]
colnames(fca_head_mat) <- fca_head_cellid
rownames(fca_head_mat) <- fca_head_geneid
提取我们需要的meta data. 由于我找不到一个H5D类的方法可以直接通过字符向量提取相应meta data，这里用了一个循环的方法。
注意将meta.data的行名设置为与基因 X 细胞矩阵匹配的细胞ID
# pull metadata from loom
attrs <- c('Barcode', 'CellID', 'ClusterID', 'n_counts', 'n_genes', 'percent_mito',
'annotation', 'annotation_broad', 'annotation_broad_extrapolated','sex')
# can't find method from loom to directly extract attributes
attrs_df <- map_dfc(attrs, ~ ds[[paste0("col_attrs/", .)]][]) %>% as.data.frame()
colnames(attrs_df) <- attrs
rownames(attrs_df) <- fca_head_cellid
构建Seurat对象
# create seurat object from loom data
fca_head_seurat <- CreateSeuratObject(counts = fca_head_mat,
meta.data = attrs_df)
又由于我找不到loom文件中降维的信息在哪一个section，这里用h5ad的降维信息 😓
同时，注意到h5ad的细胞ID和loom的细胞ID是不一样的，将其转为loom的细胞ID
fca_head_h5 <- LoadH5Seurat("data/ref/s_fca_biohub_head_10x.h5seurat")
fca_head_seurat@reductions <- fca_head_h5@reductions
rownames(fca_head_seurat@reductions$pca@cell.embeddings) <- fca_head_cellid
rownames(fca_head_seurat@reductions$tsne@cell.embeddings) <- fca_head_cellid
rownames(fca_head_seurat@reductions$umap@cell.embeddings) <- fca_head_cellid
画一个tsne plot 看看我们构建的数据是否正确
DimPlot(fca_head_seurat,
reduction = 'tsne',
group.by = 'annotation',
label = T,
label.size = 4) + NoLegend()
label 太多看不清了，但整体结构是一致的，说明我们构建成功了 😃
补充一点： Seurat团队有提到Seurat相关包可以直接对loom文件进行分析。但他这里提到的版本是Seurat V2，而现在Seurat都是V4了，而V4的函数也不能直接使用loom对象作为输入。
https://github.com/mojaveazure/loomR/issues/35
总结这次数据转换的折腾过程，问题主要是由于我对单细胞数据、文件格式和分析流程的熟悉度不足够所导致的。这让我感觉到当接触一个新的领域时，我们都只能参考软件文档中的例子进行分析，超出例子范围的操作就只能一个error、一个error的去搜索解决方案。这种debug的过程很痛苦，因为面对海量的信息，我们需要仔细地甄别哪一种是能为我们所用的，但这种debug的能力也是做生信必不可缺的。
最后，要说明我这里分享的是我探索的路径，它并不一定是最优的解决方案。
> sessionInfo()
R version 4.0.3 (2020-10-10)
Platform: x86_64-w64-mingw32/x64 (64-bit)
Running under: Windows 10 x64 (build 19041)
Matrix products: default
locale:
[1] LC_COLLATE=Chinese (Simplified)_China.936 LC_CTYPE=Chinese (Simplified)_China.936
[3] LC_MONETARY=Chinese (Simplified)_China.936 LC_NUMERIC=C
[5] LC_TIME=Chinese (Simplified)_China.936
attached base packages:
[1] stats graphics grDevices utils datasets methods base
other attached packages:
[1] Seurat_4.0.5 SeuratObject_4.0.2 SeuratDisk_0.0.0.9019 forcats_0.5.0
[5] stringr_1.4.0 dplyr_1.0.2 purrr_0.3.4 readr_1.4.0
[9] tidyr_1.1.2 tibble_3.0.4 ggplot2_3.3.5 tidyverse_1.3.0
loaded via a namespace (and not attached):
[1] Rtsne_0.15 colorspace_2.0-0 deldir_1.0-2 ellipsis_0.3.1
[5] ggridges_0.5.2 fs_1.5.0 spatstat.data_2.1-0 rstudioapi_0.13
[9] leiden_0.3.6 listenv_0.8.0 bit64_4.0.5 ggrepel_0.9.0
[13] lubridate_1.7.9.2 xml2_1.3.2 codetools_0.2-16 splines_4.0.3
[17] polyclip_1.10-0 jsonlite_1.7.2 broom_0.7.5 ica_1.0-2
[21] cluster_2.1.0 dbplyr_2.0.0 png_0.1-7 uwot_0.1.10
[25] spatstat.sparse_2.0-0 shiny_1.6.0 sctransform_0.3.2 compiler_4.0.3
[29] httr_1.4.2 backports_1.2.0 assertthat_0.2.1 Matrix_1.3-4
[33] fastmap_1.0.1 lazyeval_0.2.2 cli_2.5.0 later_1.1.0.1
[37] htmltools_0.5.1.1 tools_4.0.3 igraph_1.2.6 gtable_0.3.0
[41] glue_1.4.2 reshape2_1.4.4 RANN_2.6.1 tinytex_0.28
[45] Rcpp_1.0.7 scattermore_0.7 cellranger_1.1.0 vctrs_0.3.6
[49] nlme_3.1-149 lmtest_0.9-38 xfun_0.19 globals_0.14.0
[53] rvest_0.3.6 mime_0.9 miniUI_0.1.1.1 lifecycle_1.0.0
[57] irlba_2.3.3 goftest_1.2-2 future_1.21.0 MASS_7.3-53
[61] zoo_1.8-8 scales_1.1.1 spatstat.core_2.3-0 spatstat.utils_2.2-0
[65] hms_0.5.3 promises_1.1.1 parallel_4.0.3 RColorBrewer_1.1-2
[69] gridExtra_2.3 reticulate_1.18 pbapply_1.4-3 rpart_4.1-15
[73] stringi_1.5.3 rlang_0.4.11 pkgconfig_2.0.3 matrixStats_0.57.0
[77] lattice_0.20-41 tensor_1.5 ROCR_1.0-11 patchwork_1.1.1
[81] htmlwidgets_1.5.3 bit_4.0.4 cowplot_1.1.0 tidyselect_1.1.0
[85] parallelly_1.22.0 RcppAnnoy_0.0.18 plyr_1.8.6 magrittr_2.0.1
[89] R6_2.5.0 generics_0.1.0 DBI_1.1.1 mgcv_1.8-33
[93] pillar_1.4.7 haven_2.3.1 withr_2.4.2 fitdistrplus_1.1-3
[97] abind_1.4-5 survival_3.2-7 future.apply_1.6.0 hdf5r_1.3.4
[101] modelr_0.1.8 crayon_1.3.4 KernSmooth_2.23-17 spatstat.geom_2.2-2
[105] plotly_4.9.4.1 grid_4.0.3 readxl_1.3.1 data.table_1.13.4
[109] reprex_0.3.0 digest_0.6.27 xtable_1.8-4 httpuv_1.5.4
[113] munsell_0.5.0 viridisLite_0.3.0
Ref:
Loom file format specs: https://linnarssonlab.org/loompy/format/index.html
Seurat::as.loomDoc: https://www.rdocumentation.org/packages/Seurat/versions/3.1.4/topics/as.loomIntroduction to loomR: https://satijalab.org/loomr/loomr_tutorial
Interoperability between single-cell object formats: https://satijalab.org/seurat/articles/conversion_vignette.html
Conversions: h5Seurat and AnnData: https://mojaveazure.github.io/seurat-disk/articles/convert-anndata.html#converting-from-anndata-to-seurat-via-h5seurat-1
R convert matrix or data frame to sparseMatrix: https://stackoverflow.com/questions/10555210/r-convert-matrix-or-data-frame-to-sparsematrix
loom文件转换成seurat对象: https://www.jianshu.com/p/7067e0ec6ed8
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