作者：snail
编辑：angelica

引言

跟着阿拉丁一起学习的时间又到了～～

ATAC-seq利用DNA转座酶（Tn5）切割开放的DNA区域并结合二代高通量测序技术来研究染色质开放性的技术。

ChIP-seq是研究蛋白质与DNA相互作用的经典实验方法。该技术广泛应用于组蛋白修饰、转录因子调控等相关领域的研究。‍

1. ATAC-seq与ChIP-seq异同

ATAC-Seq （Assay for Targeting Accessible-Chromatin with high-throughout sequencing），是在全基因组范围内检测染色质的开放区域，得到蛋白质的潜在结合位点，不依赖于抗体，可用于寻找感兴趣的转录因子的binding区域及其靶基因。

ChIP-Seq（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP），即染色质免疫共沉淀技术，是揭示特定转录因子或蛋白复合物的结合区域，利用特异性抗体富集蛋白质及其结合的DNA片段，从而验证蛋白质与DNA的相互作用关系。

ATAC-Seq、ChIP-Seq数据分析的整体思路基本一致，找到富集区域（Peaks），对Peaks进行Motif分析以及功能富集等分析。

2. 已知转录因子，如何对其binding区域以及靶基因进行预测？

ChIP-Seq所研究的蛋白修饰对象如转录因子, 不考虑远距离的调控作用的情况下，其结合位点可能存在于基因的启动子（promoter）区域，且具有特定的保守序列特征。可对该转录因子的富集区域（Peaks）进行Motif分析，寻找转录因子的保守结合位点。这样就很容易知道一个Motif是否显著富集在这个区域（与背景区域相比），也就很好的回答了一个生物学问题：该转录因子是否显著地结合到该区域。

再根据ChIP-seq找到的Peaks进行注释，根据注释信息找到最近的基因。然后看这些promoter上分别有哪些富集的Motif，再与感兴趣的转录因子相对应即可得到其靶基因。

3. 联合分析可以咋搞？

3.1 ATAC-Seq与ChIP-Seq联合分析

我们可以根据ATAC-Seq预测到的转录因子的潜在结合区域，设计特异的蛋白，利用ChIP-Seq进行验证。

3.2 ATAC-Seq与转录组联合分析

ATAC-Seq具有时空特异性，联合转录组的测序结果，可以得到ATAC-Seq获得的Peaks所处的DNA序列区域，是否对应转录本的表达情况；也可得到转录本相关基因的上游调控序列，进而对基因功能分析，再结合实验表型进行讨论，从而理清楚表观调控-表达-功能-表型这样一个过程。

• 通常认为，比较组间发生差异表达的基因与表型差异可能具有因果关系，而染色质可接近性变化可能是差异表达的原因之一。可用象限图更好地对在两种组学层面都发生变化的基因进行细分，并选择关注的象限进行渐进性富集分析（GO、KEGG、GSEA等），进一步从功能层面锁定关键基因集。

注：横轴：ATAC-seq 差异 peak 信号变化倍数；纵轴： 差异表达基因差异倍数。二者间的关系（ ATAC、RNA） 根据开放性上/下调和表达上/下调分为 4 个类群。

• 启动子区域上游2kb通常被认为是基因转录起始位点（TSS），其可接近性变化会影响转录起始元件及调控元件的结合，对基因表达产生较为直接的影响。很多研究会将这一区域作为重点，关注其可接近性变化与基因转录水平的关系。那么，我们可以通过折线图和热图，展示TSS或整个转录区域上下游一定范围内的基因表达情况，折线图适合做多个基因的数据整合，热图可以显示各个基因的情况。‍

注：根据表达量将基因分为3个类群（low、med、hig），并对其TSS上下游2kb区域内进行划窗，绘制折线图（上）和热图（下，因图形较长仅截取首尾）

• 可以基于启动子区ATAC-Seq信号在比较组间变化情况，将基因分为三个类群（例如下图的：High、Dynamic、Low）；并在不同类群内，根据各基因在不同比较组内表达情况进行排序，从而统计启动子区ATAC-Seq信号强度和对应基因的表达量，绘制完整的双组学热图。

注： 双组学热图左侧为转录组、右侧为ATAC数据。横轴：不同样本；纵轴： 不同基因，按启动子开放性情况进行分群。

参考文献

[1] Meyer, C., Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet 15, 709–721 (2014).