第6篇：重复样本的处理——IDR

前言

ATAC-seq/ChIP-Seq中重复样本的处理
ATAC-Seq要求必须有2次或更多次生物学重复（十分珍贵或者稀有样本除外，但必须做至少2次技术重复）。理论上重复样本的peaks应该有高度的一致性，实际情况并不完全与预期一致。如何评价重复样本的重复性的好坏？如何得到一致性的peaks?

这一节将介绍两种方法：

1. 用Bedtools进行简单的overlap合并重复样本
2. 用IDR（Irreproducibility Discovery Rate）的方法获得高重复性的peaks

1. Overlapping peaks using bedtools

如何得到两个重复样本间一致性的peaks? 一种简单粗暴的方法就是用bedtools计算peaks的overlaps。
用法：bedtools intersect [OPTIONS] -a <bed/gff/vcf/bam> -b <bed/gff/vcf/bam>

• -a: 参数后加重复样本1（A）
• -b：参数后加重复样本2（B），也可以加多个样本

其他常用参数解释和图解如下：

• -wo：Write the original A and B entries plus the number of base pairs of overlap between the two features.
• -wa：Write the original entry in A for each overlap.
• -v：Only report those entries in A that have no overlaps with B
  如果只有-a和-b参数，返回的是相对于A的overlaps。加上参数-wo返回A和B原始的记录加上overlap的记录。参数-wa返回每个overlap中A的原始记录。
  
  使用代码示例：

bedtools intersect \
-a macs2/Nanog-rep1_peaks.narrowPeak \
-b macs2/Nanog-rep2_peaks.narrowPeak \
-wo > bedtools/Nanog-overlaps.bed

2. Irreproducibility Discovery Rate (IDR)

评估重复样本间peaks一致性的另一种方法是IDR。IDR是通过比较一对经过排序的regions/peaks 的列表，然后计算反映其重复性的值。
IDR在ENCODE和modENCODE项目中被广泛使用，也是ChIP-seq指南和标准中的一部分。

• 避免了初始阈值的选择，解决了不同callers的不可比较性
• IDR不依赖于阈值的选择，所有regions/peaks都被考虑在内。
• 它是依赖regions/peaks的排序，不要求对输入信号进行校准或标准化
  IDR的详细说明参考:
• https://github.com/nboley/idr
• https://github.com/hbctraining/In-depth-NGS-Data-Analysis-Course/blob/master/sessionV/lessons/06_handling-replicates.md#irreproducibility-discovery-rate-idr

使用IDR的注意事项：

• 建议使用IDR时，MACS2 call peaks的步骤参数设置不要过于严格，以便鉴定出更多的peaks。
• 使用IDR需要先对MACS2的结果文件narrowPeak根据-log10(p-value)进行排序。

# Call peaks
macs2 callpeak -t  sample.final.bam -n sample --shift -100 --extsize 200 --nomodel -B --SPMR -g hs --outdir Macs2_out 2> sample.macs2.log
#Sort peak by -log10(p-value)
sort -k8,8nr NAME_OF_INPUT_peaks.narrowPeak > macs/NAME_FOR_OUPUT_peaks.narrowPeak

• 使用IDR示例

idr --samples sample_Rep1_sorted_peaks.narrowPeak sample_Rep2_sorted_peaks.narrowPeak \
--input-file-type narrowPeak \
--rank p.value \
--output-file sample-idr \
--plot \
--log-output-file sample.idr.log

--samples:narrowPeak的输入文件（重复样本）
--input-file-type：输入文件格式包括narrowPeak,broadPeak,bed
--rank p.value：以p-value排序
--output-file: 输出文件路径
--plot：输出IDR度量值的结果

输出文件解读：
详细内容可参考：https://github.com/nboley/idr#output-file-format

输出文件包括：

• sample-idr
• sample-idr.log
• sample-idr.png

（1）sample-idr
sample-idr是common peaks的结果输出文件，格式与输入文件格式类似，只是多了几列信息。前10列是标准的narrowPeak格式文件，包含重复样本整合后的peaks信息。

• 第5列：包含缩放的 IDR 值
  • score int
    如min(int(log2(-125IDR), 1000)，那么IDR=0，缩放的IDR就是1000；IDR=0.05, int(-125log2(0.05)) = 540；IDR=1.0, int(-125log2(1.0) = 0。
• 第11列和第12列：分别是local和global IDR值
  • col11: localIDR float -log10(Local IDR value)
  • col12: globalIDR float -log10(Global IDR value)
    global IDR值是第5列中用于计算缩放的IDR值，类似于对p值进行多个假设校正以计算FDR；local IDR类似于属于不可重复噪声部分的峰值的后验概率。详细内容可阅读Measuring reproducibility of high-throughput experiments。
• 第13、14、15、16列：是重复样本1相关的信息。
  • col13: rep1_chromStart int
  • col14: rep1_chromEnd int
  • col15: rep1_signalValue float
  • col16: rep1_summit int
• 第17-20列：是重复样本2相关的信息，和13-16四列信息类似。

其他列信息如下：

• col1: chrom string
• col2: chromStart int
• col3: chromEnd int
• col4: name string
• col6: strand [+-.] Use '.' if no strand is assigned.
• col7: signalValue float
• col8: p-value float
• col9: q-value float
• col10: summit int

wc -l *-idr 计算下common peaks的个数，接着可再计算下与总peaks的比率。
如果想看IDR<0.05的，可以通过第5列信息过滤：
awk '{if($5 >= 540) print $0}' sample-idr | wc -l
（2）sample-idr.log
log文件会给出peaks通过IDR < 0.05的比率，如下图所示

左上： Rep1 peak ranks vs Rep2 peak ranks, 没有通过特定IDR阈值的peaks显示为红色。
右上：Rep1 log10 peak scores vs Rep2 log10 peak scores，没有通过特定IDR阈值的peaks显示为红色。
下面两个图： Peak rank vs IDR scores，箱线图展示了IDR值的分布，默认情况下，IDR值的阈值为-1E-6。

参考资料：

哈佛深度NGS数据分析课程
06-Handling replicates in ChIP-Seq