1. 阳性克隆的筛选与鉴定
重组质粒转化宿主细胞后，经过一段时间的培养即可用于进一步的筛选与鉴定，以便从被转化的细胞群体中挑出含有正确插入外源基因的重组体（即阳性克隆）
⑴ 菌落PCR鉴定阳性克隆
菌液PCR是指以挑出的菌斑在带有抗性的培养液中摇菌，之后以菌液作为PCR扩增模板。Gussow和Clackon 提出菌落PCR方法。因为进行PCR扩增时，要经过95℃的高温变性，此时细菌会发生裂解并释放出细胞内的质粒DNA，这样的质粒DNA可以作为PCR的模板，这种直接以菌体作为DNA模板的PCR技术就是菌落PCR。
由于外源DNA片段通常是利用一对特异性引物进行PCR获得并插入到载体上的，可以利用该插入片段的特异性引物进行菌落PCR，根据是否有PCR产物和产物大小可以判断是否为重组子和阳性重组子。此外，一些构建重组子的载体分子的序列是已知的，所以也可以根据载体分子多克隆位点（MCS）两侧的序列设计引物（通用引物）进行PCR扩增。
重组产物转化.png
Steps：
⑴ 挑取单克隆，于3ml含Kana（工作浓度50μg/ml）的LB液体培养基中小摇6h；
⑵ 验证体系20μL（菌液PCR）：
A. UP引物验证
PCR反应程序：
B. M13通用引物验证
PCR反应程序（延伸时间按1kb=1min）
C. 小摇12h（5ml LB液体培养液+100菌液）→小提质粒→送公司测序→DNAMAN软件序列比对
D. 大摇12h（50mlLB液体培养液+1ML菌液）→大提质粒
E. 保存至-20℃冰箱
UP连接验证.png
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