影响因子：5.7
目前多种细胞死亡模式相关相信文章易发表且分数高。另外，也可以类比多种代谢通路，多种蛋白修饰方式等等模式。
研究概述：头颈癌是全球第七大常见恶性肿瘤。细胞死亡是控制包括生长、发育、衰老和疾病在内的各种生理现象。程序性细胞死亡（PCD）可以由特定的信号转导机制和/或代谢重编程触发，包括凋亡、外在凋亡、线粒体通透性转换驱动的坏死、坏死性凋亡、铁死亡、焦亡、溶酶体依赖性细胞死亡、自噬、免疫原性细胞死亡等等。在这项研究中，作者从GEO数据库获得了HNC的五个主要亚型的scRNA-seq数据。在单细胞水平上调查了这些样本中十八种不同类型CDMs的分布。此外，选择与HNC相关的细胞死亡预后基因，使用各种机器学习算法建立共识细胞死亡相关签名风险评分（CDRscore）模型。最后进行ST原位验证以进一步验证CDRscore模型预测的结果。具体研究如下：
研究结果：
基于单细胞RNA测序图谱的HNC中不同细胞死亡模式的分布
作者从六个不同的数据集（GSE103322、GSE148673、GSE150321、GSE162025、GSE172577和GSE181919）中收集了包括甲状腺癌（TH，n=5）、口腔癌（OC，n=18）、下咽癌（HP，n=25）、口咽癌（OP，n=6）和鼻咽癌（NP，n=10）这五种主要HNC亚型的单细胞RNA测序数据（图A-B）。在这些样本中观察到了十四种CDMs；并且双硫死亡、坏死性凋亡和焦亡可能是HP中的主要CDMs，而焦亡是NP中主要的CDM。与正常组织相比，OP样本中的凋亡、铁死亡、自噬和自噬显著上调，而OC组织表现出最高的线粒体通透性转换水平；TH病例显示出极高的凋亡水平（图C）。作者还比较了正常喉（NL，n=9）、喉白斑（LP，n=4）、肿瘤组织（n=61）、HNC患者的外周血单核细胞（PBMCs，n=10）以及HNC患者淋巴结转移瘤（tLN，n=9）中这十四种CDMs的状态。结果发现：LP样本中的铁死亡和焦亡水平远高于其他样本；相反，NL样本中的自噬、自噬、免疫原性细胞死亡、铁死亡和焦亡水平比肿瘤和tLN样本更强（图D）。作者还筛选了标注有HPV感染状态的样本，并将它们分为HPV阳性（n=7）和HPV阴性（n=16）两组。结果发现：HPV阳性患者的tLN样本中的细胞死亡水平远低于NL对照组，相反，HPV阴性患者的肿瘤和tLN样本显示出显著更高的细胞死亡水平（图E）。作者还根据肿瘤-淋巴结-转移（TNM）系统，分HNC为三个不同的阶段。结果表明I期和II期的患者表现出比III期患者更高的坏死性凋亡、铜死亡和anoikis水平（图F），这表明HNC表现出不同水平的细胞死亡，而HPV感染阻止了恶性细胞中的细胞死亡。
基于单细胞RNA测序图谱的不同细胞亚群中细胞死亡模式的状态
这些HNC样本中的单细胞通过基于特征基因表达的无监督聚类被划分为十个不同的亚群（图A-B）。作者发现自体死亡、双硫死亡和免疫原性细胞死亡是所有细胞亚群中三个主要的细胞死亡模式（图2C）。并且氧死亡是tLN成纤维细胞中的主要细胞死亡模式，而从肿瘤和tLN组织中分离的免疫细胞（包括B细胞和NK/T细胞）表现出强烈的凋亡、线粒体通透性转换死亡、自噬、自噬、坏死性凋亡、焦亡、铁死亡、免疫原性细胞死亡和失巢死亡。重要的是，肿瘤组织中的恶性细胞/上皮细胞显示出显著较低的细胞死亡水平（图D），表明免疫细胞具有较高的细胞死亡水平。
肿瘤患者的T细胞表现出最高的细胞死亡水平
肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）是肿瘤间质组织中执行免疫治疗的主要细胞。TILs包括辅助性T细胞（CD4+）、细胞毒性T细胞（CD8+）、Foxp3+CD4+调节性T细胞（Tregs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、自然杀伤细胞（NKCD57+）和骨髓源抑制细胞（MDSCs）等。通过注释，T细胞进一步被细分为七个不同的亚群，包括CD8+T、CD4+T、Th17、Treg、Th1、耗竭的CD8+T细胞（CD8Tex）和增殖的CD3+T细胞（Tprolif）（图A）。作者的数据表明，CD8Tex、Treg、Th1和Tprolif主要来源于肿瘤组织，而CD4+T和NK细胞主要从PBMCs中分离出来（图B）。在肿瘤组织和正常喉组织（NL）之间，比较了CD4+T、CD8+T、CD8Tex、Th17和Treg的不同CDMs的状态，结果显示肿瘤组织中的Th17细胞表现出显著更高的碱死亡水平，而肿瘤组织中的CD4+T和Treg表现出凋亡减少（图C）。作者进一步比较了来自PBMCs的循环T细胞和肿瘤浸润T细胞之间CDMs的状态，结果显示在来自患者PBMCs的CD4+T、CD8+T和Tprolif中观察到铜死亡增强（图D）。随后，作者评估了T细胞状态和细胞死亡之间的相关性，发现细胞毒性T细胞表现出显著高水平的溶酶体相关细胞死亡，而处于终末耗竭状态的T细胞显示出高水平的焦亡和凋亡（图E）。
然后作者从TCGA数据库收集了HNC的bulk-RNA测序数据，以验证不同细胞死亡模式的分布。与NL对照相比，HNC的肿瘤样本表现出明显更高水平的坏死性凋亡、有丝分裂细胞死亡、双硫死亡、自噬、以及碱死亡，而铜死亡和线粒体通透性转换则显著减少（图A）。目前，肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定性（MSI）和免疫评分（IS）被用作预测对免疫疗法反应的指标。然而，作者观察到CDMs与MSI和TMB之间没有关联（图B）。通过ESTIMATE算法作者发现包括凋亡、自噬、免疫原性细胞死亡、溶酶体相关细胞死亡和焦亡在内的许多CDMs与基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分呈正相关，而与RNA干性评分（RNAss）呈负相关（图C）。进一步表明，凋亡、自噬、免疫原性细胞死亡、溶酶体相关细胞死亡和焦亡主要限制在T细胞中，特别是在肿瘤组织中的CD8+ T细胞（图D），这证实了HNC患者的T细胞更易发生细胞死亡。
构建共识的细胞死亡相关签名
为了探索细胞死亡的临床应用价值，作者选用单变量Cox分析从这些CDMs表达谱中鉴定出154个预后基因。这些预后基因随后被纳入机器学习中，以开发一个共识的细胞死亡相关（CDR）签名。在TCGA-HNSC数据集中，作者通过留一法交叉验证框架构建了100种预测模型，并计算了每个模型在三个验证数据集（GSE41613、GSE65858和TCGA）中的C指数。其中，最优模型是随机生存森林（RSF）和superPC（方向=both）的组合，具有最高的平均C指数（0.651），并且这个组合模型在所有验证数据集中都具有领先的C指数（图A）。此外，使用Lasso回归从最优模型中减少变量（图B-C）。接着25个细胞死亡相关基因被纳入逐步Cox比例风险回归分析，最终确定了10个基因（MRPL10、DDX19A、NDFIP1、PCMT1、HPRT1、SLC2A3、EFNB2、HK1、BTG3和MAP2K7）构建CDR评分（图D）。作者为TCGA-HNSC数据集中的每个患者计算了风险评分，然后根据由survminer包确定的最佳截止值将患者分为高风险评分组和低风险评分组。描述了风险评分、患者状态（存活或死亡）、总生存期（OS）以及这10个基因在不同临床特征中的转录情况（图E）。高风险评分组患者的OS显著低于低风险评分组（p<0.0001，图F）。ROC曲线下的面积（AUC）值为0.772，高于其他临床分类（图G）。
高风险和低风险CDRscore患者不同的特征
作者构建CDRscore模型所涉及的细胞死亡相关基因与自噬、自噬、铁死亡、免疫原性、有丝分裂细胞死亡、线粒体通透性转换、坏死性凋亡和焦亡高度相关（图A）。然后作者比较了按CDRscore模型分类高低风险评分患者的转录变化。GSEA显示大多数与免疫反应相关的途径，如T/B细胞受体信号途径和IgA产生的肠道免疫网络，在高风险CDRscore患者中显著下调，然而，与肿瘤发展相关的途径，包括上皮间质转化、细胞外基质（ECM）受体相互作用、血管生成、TGF-b信号和缺氧，显著上调（图B）。这些结果也得到了GSVA分析的支持（图C），表明高风险和低风险CDRscore患者的肿瘤微环境（TME）完全不同。随后，作者使用了七种不同的方法（TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT.ABS、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、XCELL和EPIC）来分析高风险和低风险评分组之间免疫细胞浸润的差异，结果显示高风险评分组的巨噬细胞（M0）和中性粒细胞浸润显著增加，而B细胞、巨噬细胞（M2）和CD8+ T细胞的浸润与低风险评分组相比显著减少（图D）。
基于单细胞RNA测序探索CDRscore模型在单细胞水平上的影响
作者探索了与CDRscore模型相关的十个基因在单细胞水平上的分布，发现大多数基因在恶性细胞中表达，如NDFIP1、MRPL10、HPRT1、BTG3、PCMT1和HK1。NDFIP1、PCMT1和SLC2A3的分布在所有检测到的细胞亚群中都是广泛的。然后作者比较了不同组织中风险评分的分布，结果显示正常喉组织（NL）的风险评分最低，但肿瘤、外周血单核细胞（PBMCs）和转移淋巴结（tLN）的风险评分显著升高（图A）。根据作者的CDRscore模型，GSE181919数据集中的患者也被分为高风险和低风险评分组，这两组的风险评分显示出显著差异（图B）。此外，高风险评分组中恶性细胞和T/NK细胞浸润的频率显著高于低风险评分组（图C）。高风险评分组中恶性细胞的增殖能力（图D）以及T细胞上耗竭相关标记基因（PDCD1、BACH2、ETV1、HAVCR2、LAG3和ENTPD1）的转录（图E）显著高于低风险评分组。先前的研究表明，耗竭相关标记基因的表达和恶性细胞增殖是由TGF-b信号诱导的，对TGF-b信号途径网络的分析表明，高风险评分的患者表现出更高的TGF-b信号活性（图F）。特别是TGF-b相关配体-受体对，如ACVR1-TGFBR1配体-受体对的结合增加，表明尽管高风险组中T细胞的浸润增加，但大多数T细胞被耗竭并没有发挥抗肿瘤功能（图G）。
通过空间转录组验证CDRscore模型
为了验证上述的结果，作者对2例喉鳞状细胞癌（LSCC）患者和1例正常喉控制样本进行了基于10x Genomics Visium的空间转录组（ST）测序。这种10x Genomics Visium的每个点的直径为55mm（捕获8至20个细胞），作者通过反卷积注释了ST的细胞类型，正常喉组织显示上皮细胞和成纤维细胞的高频率，而LSCC样本中恶性细胞、T细胞和B细胞显著增加（图A）。与CDRscore模型相关的基因转录在LSCC样本中显著增加（图B）。并且LSCC和正常喉组织（NL）表现出不同类型和水平的细胞死亡，恶性细胞表现出高水平的线粒体通透性转换（mpt）和凋亡，而成纤维细胞中主要的细胞死亡方式是免疫原性细胞死亡（图C）。基于CDRscore模型，LSCC样本中高风险评分被发现主要富集在恶性细胞中（图D）。在对肿瘤样本进行降维和聚类后，这种发现包含恶性细胞的cluster1和cluster2显示出比其他聚类更高的风险评分（图E）。作者还发现高风险评分的点与恶性细胞增殖（DNA复制）和TGF-b信号共定位。并且TGF-b信号和恶性细胞增殖与恶性细胞和免疫细胞交界处的高风险评分点高度重叠（图F）。此外，高风险评分与T细胞受体（TCR）信号途径相关基因的表达呈负相关，但与LAG3基因表达呈正相关（图G）。
研究总结：
本研究通过综合分析单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组（ST）和bulk RNA测序数据，旨在识别和验证与头颈癌（HNC）预后相关的细胞死亡模式（CDMs）。研究首先建立了一个包含五种主要HNC亚型的单细胞图谱，分析了不同组织和细胞亚型中CDMs的分布。研究发现，T细胞在HNC患者中表现出最高的细胞死亡水平，特别是与肿瘤细胞干细胞性、免疫相关评分和T细胞浸润正相关的CDMs。基于机器学习的方法，研究者开发了一个基于十个细胞死亡相关预后基因（包括MRPL10、DDX19A、NDFIP1等）的风险评分模型（CDRscore），该模型能够独立预测HNC患者的总体生存情况，并在外部数据集中得到验证。进一步的分析揭示了高风险和低风险CDRscore患者之间的不同生理特征，包括免疫反应相关途径的下调和肿瘤发展相关途径的上调。此外，高风险评分组的患者显示出更高的恶性细胞增殖能力和T细胞耗竭标志物的表达，以及与TGF-b信号通路的高活性相关。空间转录组数据进一步验证了CDRscore模型的预测结果，显示高风险评分主要富集在恶性细胞中，并且与TGF-b信号和DNA复制共定位，同时与TCR信号途径相关基因表达呈负相关，而与LAG3基因表达呈正相关。总体而言，本研究又是一篇基于细胞死亡的纯生信文章，利用单细胞/转录组/空间转录组等技术展示细胞死亡并且进行验证。
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