空间转录组测序技术追踪-第四期
本期我们来介绍一下经过10x Genomics公司升级后的空间转录组测序技术。
升级后的产品称为“10x Genomics Visium空间基因表达解决方案”
一、Visium芯片的更新
10x Genomics Visium空间基因表达解决方案同原始产品相同，是两种芯片，即组织优化芯片Tissue Optimization Slide和文库构建芯片Library Preparation Slide。
其中Library Preparation Slide芯片上有4个捕获区域（6.5 x 6.5 mm），每个捕获区域里有4992个被特异条形码barcode标记的spot，spot的直径为55 μm的点，每个点中含有数百万个捕获标签，相邻两点之间中心到中心的距离为100 μm。
这里需要明确的是每个spots能覆盖1-10个细胞，因而空间转录组技术并非是单细胞转录组测序技术。它是以一个sopt为单位的，捕获的几个细胞中基因表达的总和。
10x Genomics 组织优化芯片，引自10x Genomics官网https://www.10xgenomics.com
10x Genomics 文库构建芯片，引自10x Genomics官网https://www.10xgenomics.com
捕获标签的序列结构为：
1）部分测序引物结合序列（Partial Read1）；
2）18bp的Spatial Barcode；
3）7bp的umi序列和末尾的Poly(dT)VN序列；
10x Genomics 文库构建芯片spot中捕获序列的结构，引自10x Genomics官网https://www.10xgenomics.com
二、组织优化流程
TO芯片包含8个捕获区域，可同时设置7个不同的实验条件（8个中一个需设置为阴性对照）。将组织切片放置在TO芯片上后，进行不同的透化时间处理（3、6、12、18、24、30、36 min），总流程为：固定-染色-明场拍照-组织透化-cDNA合成-组织移除-荧光扫描步骤，完成组织优化实验，根据荧光强度判断最优的透化时间，小鼠小肠样本最优透化时间为24 min。
组织优化芯片：引自10x Genomics官网https://www.10xgenomics.com
小鼠小肠样本最优透化时间为24 min，引自10x Genomics官网https://www.10xgenomics.com
同时我们也可以看到不同物种不同组织的透化时间也是不同的，因而每种样本在文库构建之前都必须进行组织优化，确定最优条件以获得理想的实验结果。
引自10x Genomics官网https://www.10xgenomics.com
三、文库构建流程
正式文库构建的步骤为：1.组织切片放置在LP芯片上；2.固定；3.染色；4.明场拍照；5.透化；6.cDNA合成；7.第二链cDNA合成；8.变性；9.循环数确定；10.cDNA扩增；11.纯化和质控；12.片段化，末端修复，加A；13.连接头；14.样本index PCR。最后进行上机测序。
文库构建原理：引自10x Genomics官网https://www.10xgenomics.com
那么以上就是10x Genomics升级后的流程了，由于较原流程去掉了体外转录和过夜反转录的过程，大大缩减了实验操作的时间，由3天缩减到1天，从而更加符合产品的商业化要求，为大规模的科研应用甚至以后的临床诊断产品的研发打下了基础。
欢迎对此技术感兴趣的同仁可以留言跟我一起讨论~
后续的几期内容，我们将结合发表的空间转录组文献来思考一下该技术的研究思路是什么，如何讲一个完整的story！
「2019年11月01日 ·北京」
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